Chương 1 TỔNG QUAN
1.3. Hoạt tính kháng vi sinh vật của nano silica, oligochitosan và vật liệu lai nano
g.mol-1 chưa được cơng bố.
1.3. Hoạt tính kháng vi sinh vậtcủa nano silica, oligochitosan và vật liệu lai nano silica/oligochitosan. silica/oligochitosan.
Theo một số nghiên cứu đã được công bố, cả hai vật liệu nano silica và oligochitosan đề có khả năng kháng lại một số loại vi sinh vật. Hiệu ứng kháng vi
sinh vật của hỗn hợp hai vật liệu trên cũng đã được thử nghiệm trên một số loài vi khuẩn, vi nấm.
1.3.1. Một số nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của nano silica.
Theo Wasaki và cs (2002) [73], Ma và cs (2004) [74] và Liang và cs (2005) [75] cho rằng silica là một hoạt chất có tác dụng làm tăng sức đề kháng cho cây trồng
như: hạn chế sâu, rầy chích hút, giải độc kim loạị Cơ chế kháng vi sinh vật gây bệnh
thực vật của silica được các tác giả giả thiết là do silica liên kết, gia cố làm chắc thành tế bào thực vật chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh [76]. Cơ chế kích thích thực vật tạo kháng thể chống lại vi sinh vật bệnh thực vật trong điều kiện khí hậu bất lợi xảy ra khi silica liên kết với nhóm hydroxyl của protein dẫn truyền tín hiệu [77]. Một số cơng trình nghiên cứu cho thấy silica ở kích thước nanomet có hiệu lực sinh học cao gấp nhiều lần so với silica ở dạng vật liệu khốị Kết quả nghiên cứu của tác giả Song và cs (2009) cho thấy nano silica ở các kích thước hạt nano từ 17 – 50 nm có hiệu
ứng kháng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus cao, còn silica dạng
vi khuẩn càng cao, cụ thể nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum inhibition
concentration) của nano silica kháng Escherichia coli là 2 và 9 mg.mL-1;
Staphylococcus aureus là 1 và 7 mg.mL-1 tương ứng với kích thước hạt là 17 nm và
50 nm [78]. Theo nghiên cứu của tác giả Suriyaprabha (2013) khi sử dụng nano silica có kích thước hạt 20 - 40 nm có hiệu quả kháng nấm Fusarium oxysporum và
Aspergillus niger trên cây ngô ở liều lượng sử dụng 10 – 15 kg.ha-1 đạt hiệu quả cao
hơn gấp nhiều lần so với silica dạng vật liệu khối [79]. Nano silica cịn có khả năng
kháng bệnh trên một số cây trồng khác như bệnh phấn trắng trên cây dưa chuột [77], bệnh đạo ôn và bạc lá trên lúa [80, 81]. Ngoài khảnăng kháng vi sinh vật, El-bendary và El-Helaly (2013) trong nghiên cứu đã chứng minnh nano silica cịn có khả năng kháng sâu khoang Spodoptera littoralis gây hại cà chua, LD50 được xác định là 212
mg.L-1 và hiệu quảđạt cao nhất ở nồng độ 300 - 350 mg.L-1 [82]. Phạm Đình Dũng
và cs (2016) [44], Nguyễn Ngọc Thủy và cs (2017) [45] trong các nghiên cứu của
mình đã chứng minh nano silica sử dụng ở nồng độ 60 mg.L-1 kích thích tăng trưởng cây ớt, chúng làm gia tăng trọng lượng tươi, trọng lượng khơ và năng suất tráị Nhìn chung, các kết quả nghiên cứu về cơ chế, khả năng kháng vi sinh vật và các loại dịch hại thực vật của nano silica mới bắt đầu được nghiên cứụ
1.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật của oligochitosan.
Chitosan và oligochitosan có tính chất hóa học và nhiều hoạt tính sinh học
được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như vật liệu kháng nấm [83], kháng vi khuẩn [84,
85], kháng các khối u, bướu [17, 86], chất tăng cường khả năng miễn dịch [87], bảo vệ chống lại sự nhiễm trùng và oxi hóa [88-90], sử dụng làm vắc xin thực vật [23, 24, 91] và xử lý môi trường [92, 93]. Các đặc tính chất kháng vi sinh vật của oligochitosan phụ thuộc vào khối lượng phân tử, mức độ polyme hóa (DP) [94], độ đề acetyl hóa (ĐA) [95, 96], cấu trúc (α, β, γ) và loại vi sinh vật tiếp xúc [97]. Độ lớn và sự phân bố điện tích trên chitosan, oligochitosan, các dẫn xuất của chitosan có ảnh hưởng lớn
đến hoạt tính sinh học của chúng.
Chitosan và oligochitosan chứa các nhóm chức amino, số nhóm amino này có vai trị quan trọng trong hoạt tính kháng vi sinh vật theo cơ chế được Hosseinnejad và cs (2016) [98] và Chen và cs (2002) [99] mơ tả theo hình 1.8. Cơ chế được cho là phù hợp cho rằng chitosan hoặc oligochitosan có thể làm thay đổi các đặc tính thẩm thấu của màng tế bào vi sinh vật, ngăn cản sự tiếp nhận khoáng chất hoặc phá hủy
các thành phần tế bào làm vi sinh vật chết [100]. Một cơ chế khác đưa ra để giải thích về hoạt tính kháng vi sinh vật của oligochitosan là sự ngăn chặn việc sao chép RNA khi oligochitosan thâm nhập vào DNA của vi sinh vật [101]. Để đáp ứng được cơ chế này, khối lượng phân tử của chitosan phải nhỏ hơn một giá trị giới hạn nhất định, cho phép các phân tử xâm nhập vào trong tế bào vi khuẩn, tuy nhiên các kết quả nghiên cứu đến nay chưa đủ để củng cố giả thuyết nàỵ Một giả thuyết khác cho rằng,
oligochitosan có khả năng tạo chelat với ion kim loại có trong màng tế và gây rối loạn biến dưỡng các chất dinh dưỡng thiết yếu tới sự sinh trưởng của vi khuẩn dẫn đến vi sinh vật chết [102].
Hình 1.8. Cơ chế kháng vi sinh vật của chitosan và oligochitosan [69].
Có nhiều nghiên cứu sử dụng chitosan và oligochitosan trên thực vật chứng minh rằng chúng có khả năng kích thích cây trồng tạo ra kháng thể chống lại vi sinh vật gây bệnh, vì vậy nó được coi như một vacxin thực vật [23-25]. Theo Klarzynski và Fritig, chất kích kháng “elicitor” được định nghĩa là những hợp chất có khả năng kích thích cây trồng sinh ra những phản vệ đề kháng lại các tác động của các vi sinh vật (nấm, virút, vi khuẩn) [103]. Cơ chế kích kháng của oligochitosan được mơ phỏng theo hình 1.9.
Khả năng tạo kháng thể phytoalexin thực vật của oligochitosan đã được chứng minh trong một số nghiên cứu kháng lại bệnh gây hại trên một số loại cây trồng như lúa, thuốc lá, nho, cà rốt. Nghiên cứu của Molloy và cs cho thấy oligochitosan có khả
năng kháng nấm Sclerotinias clerotiorum gây bệnh cho cà rốt [97]. Oligochitosan
còn ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm Fusarium và kích thích sản sinh phytoalexin
ức chế hoàn toàn sự nảy mầm của bào tử nấm Botrytis và kiểm soát nấm mốc xám do
nấm Botrytis cinerea gây ra trên cây dưa chuột. Cây dưa chuột được xử lý oligochitosan trước khi lây nhiễm nấm Botrytis cinerea gây bệnh mốc xám đã làm
giảm gần 90% tỉ lệ bệnh so với đối chứng. Oligochitosan khối lượng phân tử thấp có hiệu quả hơn trong việc sinh ra các phản ứng phòng vệ so với các oligochitosan có khối lượng phân tử cao, thể hiện qua hiệu quả chống lại bệnh đạo ôn do nấm
Magnaporthe grisea gây ra trên cây lúa [106]. Oligochitosan còn được nghiên cứu sử
dụng phòng bệnh vi rút khảm thuốc lá ở nồng độ 50 µg.mL-1 [107]. Ait Barka và cs cơng bố rằng oligochitosan có khảnăng phịng ngừa bệnh mốc xám do nấm Botrytis
cinerea gây hại cây nho [93]. Một số nghiên cứu về hiệu ứng kiểm soát bệnh trên cây
lương thực cũng cho thấy oligochitosan có hiệu lực caọ Agrawal và cs (2002) công
bố rằng sau khi xử lý oligochitosan 0,1%, cây lúa có khả năng kích thích phản ứng phịng vệ (ROS) kháng lại vi sinh vật gây hại [109]. Ngoài ra, các nghiên cứu trên lúa mì chỉ ra rằng oligochitosan có khối lượng phân tử từ 5.000 – 10.000 g.mol-1 có ĐA 65% có hiệu quả cao đối với việc kiểm soát nấm Bipolaris sorokiniana gây bệnh (Burkhanova và cs, 2007) [20].
Hình 1.9. Cơ chế kích kháng sinh học trên cây trồng khi có tác động của
oligoglucan, oligochitosan [104].
Ở Việt Nam, đã có một số kết quả thí nghiệm khảo sát hiệu quảkích thích tăng trưởng và kiểm soát nấm bệnh của oligochitosan. Oligochitosan (KLPT 4.000 – 6.000
bệnh thán thư trên cây ớt được công bố bởi Phạm Đình Dũng và cs (2016) [44, 110]. Tác giả Nguyễn Quốc Hiến và Bùi Phước Phúc (2015) trong nghiên cứu của mình đã xác nhận oligochitosan có hiệu ứng kích thích tăng trưởng đối với cây mía và cây lúa [111]. Đặng Xuân Dự (2015) báo cáo rằng oligochitosan có khối lượng phân tử 15.000 g.mol-1 có hiệu quả kháng khuẩn Escherichia coli cao (~99%) ở nồng độ 400 mg.L-1 [19]. Bùi Duy Du và cs (2015) nghiên cứu khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra trên cây thanh long do kích thích sản sinh enzyme chitinase khi xử lý oligochitosan (khối lượng phân tử ~5.000 g.mol-1) ở nồng
độ 150 mg.L-1đạt hiệu quả 81% so với đối chứng [112].
Khả năng đề kháng của chitosan và oligochitosan đối với một số loại vi khuẩn, vi nấm được coi là đặc tính có vai trị quan trọng nhất liên quan đến khả năng ứng
dụng của chúng. Theo Jeon và cs, oligochitosan có khối lượng phân tử nhỏ từ 1.000 - 10.000 g.mol-1 cho thấy có hoạt tính kháng hầu hết các vi khuẩn và hoạt tính kháng khuẩn tăng theo chiều tăng khối lượng phân tử [93]. Đặc tính quan trọng giúp
oligochitosan có tính ứng dụng cao là mặc dù nó kháng lại hầu hết các loại vi sinh vật gây bệnh nhưng không gây hại cho các loại vi sinh vật có lợi chẳng hạn như vi khuẩn lactic, vi nấm trichoderma.
1.3.3. Hoạt tính kiểm sốtbệnhthực vậtcủa vật liệu lai nano silica/chitosan.
Vật liệu được tạo ra giữa nano silica và oligochitosan được kỳ vọng sẽ thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật của cả hai pha vô cơ và hữu cơ. Tiềm năng sử dụng vật liệu lai nano silica/oligochitosan trong kháng vi khuẩn, vi nấm nêu trên là rất lớn vì hiệu ứng cộng hợp kiểm sốt và kích kháng bệnh thực vật. Vật liệu lai nano
silica/chitosan có khả năng kháng bệnh héo rũ do nấm Ralstonia Solanacearum gây ra trên cây cà chua được nghiên cứu bởi Kiirika và cs (2013) [113], kháng bệnh thối rễ do nấm Monilinia fructifolia gây ra trên cây táo bởi L. Yang và cs (2010) [114]. Theo nghiên cứu của Phạm Đình Dũng và cs (2016), Nguyễn Ngọc Thủy và cs (2017) cho thấy vật liệu lai giữa oligochitosan và nano silica có hiệu ứng kích thích tăng
trưởng và kháng bệnh thán thư trên cây ớt [45, 110]. Sử dụng oligochitosan/nano
silica với nồng độ tương ứng 50 mg.L−1, 50 mg.L−1 đã gia tăng trọng lượng khô, trọng
lượng tươi, chiều cao cây và hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b so với đối chứng.
Thí nghiệm xử lý bằng cách phun dung dịch oligochitosan/nano silica trên cây ớt trước lây nhiễm nhân tạo nấm Colletotrichum spp. gây bệnh thán thư đã làm nấm
bệnh không thể sinh trưởng, cịn thí nghiệm đối chứng khơng phun
oligochitosan/nano silica thì nấm bệnh phát triển với tỉ lệ bệnh là 100% sau 35 ngày lây nhiễm nấm.
Ngoài ứng dụng trong kiểm soát nấm bệnh thực vật, vật liệu nano
silica/chitosan còn được nghiên cứu sử dụng trong bảo quản nông sản, thực phẩm. Ví dụ, nano silica/chitosan có khả năng chống sự xâm nhập của vi sinh vật trong nhiều loại nơng sản như quả nhót tây (Eriobotrya japonica Lindl.) trong nghiên cứu của Song và cs (2016) [115]. Chitosan/silica còn được nghiên cứu chế tạo màng sinh học chứa 1% chitosan và 0,04% silica, nó được sử dụng để bọc bảo quản quả táo ở nhiệt
độ thường, tác dụng của màng bọc đã làm tăng hàm lượng các enzyme chống oxy hóa
và làm chậm q trình suy giảm hàm lượng các chất dinh dưỡng như flavonoid và vitamin C trong trái cây [116]. Màng bọc chitosan/SiO2 sử dụng để bảo quản quả nhãn
đã làm giảm chỉ số hóa nâu, hạn chế mất khối lượng, giảm hàm lượng các chất
malondialdehyde và polyphenoloxidase trong trái [117]. Trong các nghiên cứu này, các tác giảcũng đã chứng minh màng bào quản trái cây nano silica/chitosan có hiệu
ứng kháng khuẩn cao hơn so với màng chitosan không chứa nano silica [110, 117].
Hiện nay các công bố về tổng hợp và nghiên cứu khả năng kháng các loại vi sinh vật gây bệnh thực vật, khả năng sản sinh các protein liên quan đến mầm bệnh để chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh thực vật của vật liệu nano silica/oligochitosan còn hạn chế vì chúng mới được tập trung nghiên cứu trong vài
năm gần đây. Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu tổng hợp và thử nghiệm hiệu ứng
kiểm sát bệnh thực vật của vật liệu nano silica/oligochitosan trên các đối tượng bệnh và cây trồng được nghiên cứu là có tính mới về khoa học và thực tiễn.
1.4. Triển vọngcủa việc sử dụng vật liệu nano silica/oligochitosan làm chất kiểm
soát bệnh thực vật.
Ngành trồng trọt có vai trị quan trọng trong sản xuất nơng nghiệp tại, nó chiếm 75% giá trị trong sản xuất nơng nghiệp. Theo thống kê năm 2019 diện tích đất sản xuất nông nghiệp vào khoảng 11,5 triệu hạ Các loại nơng sản chủ lực, có sản lượng cao và giá trị xuất khẩu của Việt Nam là cao su, cà phê, hồ tiêu, lúa, thanh long, rau củ và các loại cây lương thực khác, ... Để đạt hiệu quả trong sản xuất nông nghiệp cần thiết phải sử dụng thuốc bảo vệ thực vật để kiểm soát các loại bệnh gây hại cây trồng. Các loại thuốc bảo vệ thực vật sử dụng hiện nay thường là thuốc tổng hợp hóa
học độc hại ảnh hưởng tới sức khỏe con người, để lại tồn dư trong nông sản gây nguy
cơ ngộ độc thực phẩm và gây ô nhiễm mơi trường. Vì vậy, để đáp ứng nền sản xuất
nơng nghiệp an tồn, cần thiết phải phát triển các loại thuốc BVTV thế hệ mới, ít độc, an toàn, hiệu quả cao thay thế thuốc bảo vệ thực vật độc hạị
Các loại bệnh gây hại thực vật và xuất hiện thường xuyên ảnh hưởng tới năng suất, chất lượng nông sản trên các loại cây trồng chủ lực tại Việt Nam là: bệnh đốm nâu trên cây thanh long do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra, bệnh tuyến trùng hại rễ trên cà phê, hồ tiêu, cây ăn trái, cây rau màu, bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia
oryzae, bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây ra trên cây lúa, bệnh nấm hồng (Corticium salmonicolor) trên cây cao su, bệnh vàng lá thối rễ trên cây ăn trái, …
Bằng phương pháp tiếp cận hệ thống các tài liệu nghiên cứu về khả năng kích kháng, và kiểm sốt nấm bệnh thực vật của các loại vật liệu nano silica, oligochitosan, vật liệu nano silica/oligochitosan cho thấy chúng có triển vọng làm thuốc bảo vệ thực vật kiểm soát bệnh phổ rộng. Để nghiên cứu hiệu lực sinh học của vật liệu nano silica/oligochitosan, luận án này chọn đối tượng nghiên cứu là bệnh đốm nâu trên cây thanh long chưa có thuốc đặc trị và các bệnh thường xuyên xuất hiện, gây ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và năng suất nông sản là bệnh đạo ôn và bạc lá trên cây lúa, bệnh nấm hồng trên cây cao sụ
Bệnh đốm nâu trên cây thanh long: Thanh long loại cây ăn trái có giá trị xuất
khẩu, được trồng tập trung ở các tỉnh như Bình Thuận (khoảng 27.000 ha), Long An (khoảng 7.000 ha), Tiền Giang (khoảng 4.000 ha) và rải rác ở một số tỉnh khác. Cây thanh long thường bị nhiễm nhiều loại bệnh như bệnh thán thư, thối quả, thối cành và
đặc biệt là bệnh đốm nâu làm giảm năng suất, chất lượng quả. Bệnh đốm nâu trên cây
thanh long do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra và tồn tại quanh năm. Vào mùa khô, bệnh đốm nâu gây hại chủ yếu ở các đoạn gốc cành, mùa mưa bệnh phát tán
mạnh lan sang các cành non mới ra, hoa và quả thanh long [118, 119]. Khi cây thanh long mới chớm nhiễm bệnh, các đốm bệnh màu nâu xuất hiện trên cành với tỷ lệ bệnh từ 1 - 5%. Trong mùa mưa, thông thường các vườn thanh long bị nhiễm bệnh nặng, vết bệnh ăn sâu vào trong mạch gỗ và từ từ chuyển sang màu cam, nâu với tỷ lệ bệnh từ 10 - 50% (Hình 1.10). Hiện nay, bệnh đốm nâu trên cây thanh long chưa có thuốc
đặc trị, biện pháp kiểm sốt nấm bệnh được Cục Bảo vệ thực vật khuyến cáo là thường
đối, sử dụng luân phiên các loại thuốc thuốc bảo vệ thực vật có khả năng kháng nấm.
Mặc dù bệnh đốm nâu trên cây thanh long mới xuất hiện trong vài năm gần
đây, cũng đã có một số cơng trình nghiên cứu sử dụng các loại vật liệu khác nhau để
hạn chế sự phát triển của chúng. Tác giả Bùi Duy Du và cs công bố rằng oligochitosan khối lượng phân tử 5.000 g.mol-1 ở nồng độ 150 mg.L-1 có khả năng kích thích sản sinh enzyme chitinase trên cây thanh long kháng bệnh đốm nâu do nấm
Neoscytalidium dimidiatum với hiệu lực kiểm soát đạt 81% so với đối chứng [112].