Chương 2 THỰC NGHIỆM
2.2. Thực nghiệm
2.2.2. Điều chế oligochitosan khối lượng phân tử từ 3.00 0– 7.000 g.mol-1
Oligochitosan có khối lượng phân tử khác nhau (KLPT1 ~3.000 g.mol-1; KLPT2 ~5.000 g.mol-1; KLPT3 ~7.000 g.mol-1) được điều chế bằng phương pháp sử dụng tác nhân oxy hóa H2O2 kết hợp chiếu xạ tia Co-60 theo 03 bậc (03 lần bổ sung H2O2 đạt 0,5%) cắt đứt liên kết β-1,4 glucozit giữa các đơn phân tử D-glucosamin
trong mạch chitosan như sau:
Hòa tan 4,4 g chitosan (chitosan 10% độ ẩm) trong 80 mL dung dịch axit lactic
2%, thêm 3,33 mL dung dịch H2O2 30% để ngâm trong 24 giờ, thêm 1,67 mL dung
dịch H2O2 30% và nước cất để thu được 100 mL dung dịch chứa 4% chitosan. Dung dịch trên được chiếu xạ với liều chiếu xạ từ 7 - 49 kGy ở áp suất và nhiệt độ thường
trên nguồn chiếu xạ công nghiệp gamma SVST Co-60/B irradiator với nguồn xạ tia Co-60 với suất liều là 1,12 kGy/giờ tại Trung tâm Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ TP.HCM.
Sau mỗi lần chiếu xạ với liều chiếu xạ7 kGy đều bổ sung 1,67 mL dung dịch H2O2 30% vào dung dịch chitosan để chiếu xạ tiếp cho đến liều chiếu xạ 21 kGy (03 lần bổ sung H2O2 đạt nồng độ 0,5%). Sau liều chiếu xạ 21 kGy thì khơng bổ sung H2O2. Sau mỗi liều chiếu xạ 7 kGy, mẫu bột oligochitosan thu được từ kết tủa dung dịch oligochitosan bằng cách thêm cồn tuyệt đối 99,5% tỷ lệ thể tích cồn/dung dịch oligochitosan ~ 4/1 và sấy khô ở 60 oC. Mẫu oligochitosan được xác định khối lượng phân tử bằng phương pháp sắc lý lọc gel (GPC), đo phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) và giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD). Mẫu được bảo quản để làm thí nghiệm tiếp theọ
Hình 2.3. Quy trình điều chế oligochitosan có khối lượng phân tử khác nhaụ 2.2.3. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan. 2.2.3. Điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan.
2.2.3.1. Điều chế vật liệunano silica/oligochitosan bằng phương pháp phối trộn.
Quy trình điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương pháp phối trộn nano silica và oligochitosan theo quy trình ở hình 2.4 như sau:
Hỗn hợp CS 4%/ H2O2 1% Chitosan (KLPT ~44.500 g.mol-1)
H2O2
Axit lactic
Dung dịch CS 4%
Chiếu xạ dung dịch CS 4%/ H2O2 0,5% Bổ sung H2O2 sau
mỗi đợt chiếu xạ
OC có khối lượng phân tử khác nhau Kết tủa bằng Cồn
Chiếu xạ theo 03 bậc (03 lần chiếu xạ 7 kGy
Hình 2.4. Quy trình điều chế vật liệu nano SiO2/OC bằng phương pháp phối trộn.
a) Nghiên cứu ảnh hưởng khối lượng phân tử OC đến kích thước hạt nano silicạ
Pha dung dịch oligochitosan 2% (w/v): Cân 2 g OC có khối lượng phân tử khác nhau (KLPT1 ~3.000 g.mol-1; KLPT2 ~5.000 g.mol-1; KLPT3 ~7.000 g.mol-1)
thu được ở mục 2.2.3 hòa tan 100 mL dung dịch axit lactic 1% (w/v) thu được dung dịch OC có pH ~4. Điều chỉnh đến pH dung dịch đến 5,5 – 6,0 bằng dung dịch NaOH 1N. Tẩm ướt 1,5 g nano silica bằng 5 mL hỗn hợp C2H5OH/H2O (v/v) ~ 1/1, để trương trong 15 phút. Cho nano silica đã tẩm ướt vào dung dịch OC đã chuẩn bịở trên, thêm
nước đủ 100 mL, khuấy liên tục trong 10 giờ (tốc độ khuấy 400 v/p), thu được vật
liệu nano silica/oligochitosan. Vật liệu nano silica/oligochitosan được đo phổ FT-IR, giản đồ XRD và chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM).
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano silica đến kích thước hạt.
Tẩm ướt lần lượt 1,0 g; 1,5 g và 2,0 g nano silica bằng 5 mL hỗn hợp C2H5OH/H2O (v/v) ~ 1/1, để trương trong 15 phút. Cho nano silica đã tẩm ướt vào 90 mL dung dịch oligochitosan (OC3000) đã chuẩn bị ở trên, thêm nước đủ 100 mL, khuấy liên tục trong 10 giờ (tốc độ khuấy 400 v/p), thu được vật liệu nano silica/oligochitosan với các hàm lượng SiO2 lần lượt là 1,0%; 1,5% và 2,0% (w/v).
Vật liệu nano silica/oligochitosan được đo phổ FT-IR, UV-vis, giản đồ XRD và chụp
ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để theo dõi sự tăng kích thước hạt theo thời gian và xác định độ bền bằng cách đo thế điện kép zetạ
2.2.3.2. Điều chế vật liệu nano silica/oligochitosan bằng phương pháp kết tủa nano SiO2 trong dung dịch oligochitosan.
Quy trình điều chế vật liệu nano silica/oligochitosan bằng phương pháp kết tủa OC KLPT khác nhau
Dung dịch OC 2% Nano SiO2 đã tẩm ướt
Vật liệu lai nano silica/oligochitosan
Nano SiO2 (dtb ~ 45 nm)
Đ axit lactic 1% Tẩm ướt trong hỗn hợp C2H5OH/H2O ~ 1/1
Khuấy 30 phút, chỉnh pH ~6
nano SiO2 trong dung dịch oligochitosan tương tự như quy trình tạo gel nano
SiO2/chitosan được trình bày theo hình 2.5 như sau:
Hình 2.5. Quy trình điều chế vật liệu lai nano silica/oligochitosan bằng phương
pháp kết tủa nano SiO2 trong dung dịch oligochitosan.
Vật liệu nano silica/oligochitosan chứa nano SiO2 1,0%; 1,5% và 2% được
phân tán trong dung dịch 2% oligochitosan 3.000 g.mol-1 được điều chế như sau: Pha 03 loại dung dịch Na2SiO3, mỗi loại 30 mL có hàm lượng SiO2 lần lượt là 2%; 3% và 4% từ dung dịch Na2SiO3 12% chiết từ tro vỏ trấu (mục 2.2.1). Đồng thời pha 03 mẫu, mỗi mẫu 50 mL dung dịch 4% oligochitosan 3.000 g.mol-1 trong dung môi axit lactic 2%. Thêm vào mỗi mẫu 4,93 g HCl 37% để đạt nồng độ HCl 1N dùng phản ứng với Na2SiO3 hình thành nano silica trong dung dịch oligochitosan
Vừa nhỏ từ từ vừa khuấy lần lượt 03 loại dung dịch Na2SiO3 đã chuẩn bị ở trên vào 03 cốc chứa 50 mL 4% oligochitosan 3.000 g.mol-1. Dùng NaOH 1N nhỏ giọt
điều chỉnh dung dịch đến pH ~6,5, thu được các dung dịch keo nano
silica/oligochitosan có nồng độ OC3000 2% và hàm lượng nano silica lần lượt là 1,0%, 1,5 và 2,0%. Vật liệu nano silica/oligochitosan được đo phổ FT-IR, UV-vis, giản đồ XRD và chụp ảnh kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để theo dõi sự tăng
kích thước hạt theo thời gian và xác định độ bền bằng cách đo thếđiện kép zetạ
2.2.4. Xác định độc tính của vật liệu lai nano silica/oligohitosan.
2.2.4.1. Xác định độc tính cấp (LD50).
Độc tính cấp của vật liệu nano silica/oligohitosan xác định theo phương pháp
Litchfield-Wilcoxon của WHO và Behrens-Karber [125, 126] tiến hành như sau: SiO2 tro vỏ trấu
Nhỏ từ từ
Dung dịch Na2SiO3: SiO2 2%; 3% và 4% Dung dịch OC 4%
Hình thành gel nSiO2/OC
OC (KLPT ~3.000 g.mol-1) Dung dịch NaOH 1N Dung dịch axit lactic 2%
Vật liệu lai nano silica/oligochitosan
Độc tính cấp (LD) của vật liệu nano silica/oligohitosan thử nghiệm trên chuột nhắt, cho uống qua đường miệng. Trước khi cho uống thuốc thử, chuột bị bỏ đói trong 18 giờ. Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 3 lô: mỗi lô 6 con gồm 3 con đực và 3 con cáị Lô chuột đối chứng uống nước cất, các lô thử uống vật liệu nano
silica/oligochitosan (SiO2 1,5%/OC3000 2%) với các mức liều lượng gồm 300 mg.kg- 1, 3.000 mg.kg-1 thể trọng. Mỗi con chuột uống thuốc thử 3 lần trong thời gian 24 giờ,
mỗi lần uống cách nhau ít nhất 3 giờ. Nước cất và thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù với cùng thể tích 0,2 mL dung dịch/10 g thể trọng chuột/lần.
Theo dõi tình trạng sức khỏe chung và số lượng chuột chết ở mỗi lơ thí nghiệm
trong sau thời gian 24 giờ. Tiếp tục theo dõi tình trạng chung của chuột đến hết ngày
thứ 15 sau khi uống thuốc thử lần đầụ Xác định liều cao nhất chuột không chết và liều thấp nhất gây chết 100% số chuột.
2.2.4.2. Xác địnhđộc tínhkích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột.
Độc tính kích ứng da (nhạy cảm da) trên chuột của vật liệu nano
silica/oligochitosan (SiO2 1,5%/OC3000 2%) bằng được xác định bằng thử nghiệm
Buehler. Quy trình tiến hành như sau:
Trước thời gian 24 giờ tiến hành thử nghiệm, cạo sạch lông ở vùng lưng của chuột nhắt. Thuốc thử sử dụng vật liệu nano silica/oligochitosan nguyên trạng. Mẫu thử được bôi lên vùng da đã cạo lông và theo dõi phản ứng của vật liệu với da chuột. Thử nghiệm được thực hiện trên 3 nhóm chuột.
Nhóm thửvật liệu: Gồm 20 con chuột nhắt trắng (10 đực và 10 cái). Chất tiếp
xúc vùng da nhạy cảm là mẫu vật liệu nano silica/oligochitosan (dùng nguyên mẫu).
Nhóm đối chứng âm: Gồm 06 con (03 đực và 03 cái). Chất tiếp xúc vùng da
nhạy cảm là nước cất.
Nhóm đối chứng dương: Gồm 06 con (03 đực và 03 cái). Chất tiếp xúc vùng
da nhạy cảm là 2,4-dinitrochlorobenzene, với nồng độ là 8 mg.mL-1.
2.2.5. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long
của vật liệu nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan.
2.2.5.1. Chuẩn bị dịch bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Môi trường thạch PDA (Potato dextrose agar) và môi trường lỏng PDB (Potato
kg.cm-2 và nhiêt độ 121oC trong 30 phút trước khi sử dụng. Quy trình chuẩn bị dịch
bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum bao gồm các bước như sau:
Bước 1: Giống nấm Neoscytalidium dimidiatum được nhân giống cấp 1 trên mơi trường PDA ở nhiệt độ phịng (28 ± 2oC) trong 5 ngàỵ
Bước 2: Cấy chuyền nấm Neoscytalidium dimidiatum vào 200 mL dung dịch môi trường PDB chứa trong bình tam giác 500 mL. Bình chứa nấm được nuôi trên
máy lắc liên tục (tốc độ khuấy 120 vòng.phút-1) ở nhiệt độ phòng (28 ± 2oC) trong thời gian 4 ngày thu được dịch huyền phù nấm Neoscytalidium dimidiatum có mật độ 1 x 104 CfụmL-1. Dịch huyền phù nấm sử dụng để nghiên cứu in vivo hiệu ứng kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long của các vật liệu nano silica, oligochitosan và nano silica/oligochitosan theo phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạọ
2.2.5.2. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soátbệnhđốm nâu thanh long.
Thí nghiệm nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm soát bệnh đốm nâu thanh long theo
phương pháp tác giả Zahid (2014) [127]; Ali (2014) [128], Thanh (2016) [118] và
theo TCCS 162:2014/BVTV [129]. Các điều kiện thí nghiệm như sau: Giống thanh long ruột trắng 5 năm tuổị Phân bón sử dụng trong thí nghiệm dựa trên nhu cầu dinh
dưỡng của cây thanh long là 250 gr N + 165 gr P2O5 + 250 gr K2O/trụ/vụ, bón làm 3 đợt là sau thu hoạch, trước khi ra hoa và sau khi đậu quả.
Kích thước của mỗi ô thử nghiệm là 9 trụ (81 m2), giữa các ơ thí nghiệm được
ngăn cách bằng một hàng trụ thanh long xung quanh để khi xử lý vật liệu và lây nhiễm
nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum từ không bay từ ơ này sang ơ khác. Thí nghiệm
được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lạị
Thí nghiệm bao gồm các vật liệu xử lý: oligochitosan có khối lượng phân tử ~3.000 g.mol-1 (OC3000); ~5.000 g.mol-1 (OC5000); ~7.000 g.mol-1 (OC7000); nano silica và nano SiO2/OC3000 với nồng độ phun 150 mg.L-1; thí nghiệm đối chứng âm phun nước lã và không lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum; thí nghiệm đối chứng dương phun nước lã và không lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Phương pháp xử lý vật liệu và lây nhiễm nhân tạo nấm Neoscytalidium dimidiatum gồm các bước như sau:
Bước 1: Các trụ thanh long được xử lý các vật liệu ướt đều với thể tích phun từ
2 - 2,5 lít/trụ.
dịch bào tử nấm Neoscytalidium dimidiatum có mật độ 1 102 CfụmL-1 ướt đều trụ thanh long với thể tích 1,5 lít/trụ.
Thu mẫu thí nghiệm: Dây thanh được cắt tại 3 vị trí khác nhau trên cùng một cây, mỗi đoạn 20 cm, mẫu được bảo quản lạnh từ 0 – 5oC. Mẫu dây thanh long được xử lý bằng nitơ lỏng trước khi nghiền. Nghiền 50 g mẫu với 50 mL dung dịch đệm phốtphat (pH 7,5), ly tâm và thu dịch để xác định hoạt tính enzyme chitinasẹ
Xác định hoạt độ enzyme chitinase, tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu tại thời
điểm trước lây nhiễm và thời gian 24 giờ, 72 giờ, 120 giờ, 168 giờ sau lây nhiễm bào
tử nấm Neoscytalidium dimidiatum trên dây thanh long.
Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase trong cây thanh long.
Hoạt độ enzyme chitinase trên cây thanh long được xác định theo phương pháp
được mô tả bởi các tác giả Miller (1959) [130] và tác giả Tonon và cs (1998) [131].
Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân chitin bởi chitinase thành
N-acetylglucosamin (GlcNAc) theo cơ chế trình bày trong Hình 2.6.
Hình 2.6. Phản ứng thủy phân chitin bằng enzyme chitinnasẹ
GlcNAc là một loại đường khử. Đường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ khử thuốc thử DNS (axit 3,5-dinitrosalicylic) màu vàng thành axit 3-amino-5- nitrosalicylic màu đỏ da cam (Hình 2.7). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với mật độ quang (OD - Optical density) tại bước sóng 540 nm và hàm lượng
đường khử trong mẫụ
Hình 2.7. Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS.
Dựa vào đồ thị chuẩn với nồng độ của N-acetylglucosamin tinh khiết và OD
ở 540 nm tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu, qua đó biết được
Axit 3,5-dinitrosalicylic
(màu vàng) Axit 3-amino-5-nitrosalicylic (màu da cam)
Đường khử trong môi trường kiềm nóng
hoạt tính chitinase của enzymẹ
Tiến hành: Hàm lượng chitinase xác định bằng cách đo lượng N-acetyl- glucosamine được giải phóng từ phản ứng thủy phân chitin. Keo chitin (10 mg.mL-1 hòa trong dung dịch đệm phốtphat, pH 7,5) được sử dụng làm cơ chất phản ứng với enzymẹ Hỗn hợp phản ứng enzyme gồm 2 mg.mL-1 huyền phù chitin ở pH 7,5 và 2 mL dịch chiết enzyme được ủ thời gian 3 giờ trong bể ổn nhiệt 45oC. Dừng phản ứng bằng cách đun sôi cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng và bổ sung 2 mL dung dịch NaOH 2M. Hỗn hợp dung dịch phản ứng (6 mL) được chia ra làm 02 ống nghiệm. Tiếp theo, mỗi ống được thêm 1 mL DNS, đun sôi cách thủy trong 5 phút và làm nguội xuống nhiệt độ phòng (~30oC). Dung dịch trong ống
nghiệm đưa vào cuvet để đo cường độ hấp thụ tại bước sóng 540 nm trên máy UV- vis. Cường độ hấp thụ trung bình của dung dịch trong 2 ống nghiệm nêu trên được
xác định trên thiết bị UV- Vis Model V630; hãng Jasco - Nhật Bản tại Trung tâm
Nghiên cứu và Triển khai Công nghệ Bức xạ TP.HCM và so sánh với đường chuẩn
đểxác định hàm lượng đường khử giải phóng rạ
Dung dịch Glc-NAc trong đệm phosphate với nồng độ từ 0,1 đến 1,0 μmol.mL- 1 được sử dụng để thiết lập đường chuẩn (y = 1,3587x - 0,1538; R2 = 0,9949) để biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ vào lượng đường khử. Hoạt độ chitinase (CA) của các mẫu cây thanh long được tính theo cơng thức:
CA = (X.k.V).(v.t)-1
Trong đó: CA là hoạt tính enzyme chitinase (U/g); X là lượng đường khử được
giải phóng trong q trình thủy phân chitin (g.g-1); k là hệ số pha lỗng; V là tổng thể tích của dịch phản ứng (mL); v là thể tích của dịch chiết enzyme sử dụng (mL); t là thời gian phản ứng (phút).
Phương pháp xác định tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu thanh long [118, 127, 129].
Mỗi ơ thí nghiệm chọn ngẫu nhiên 3 trụ thanh long để điều tra cố định trong suốt thời gian thực hiện. Trên mỗi trụ theo dõi 16 dây cố định, đại diện cho 4 hướng, mỗi dây theo dõi một đoạn dài 50 cm (được tính từ đỉnh cành trở vào). Quan sát và phân cấp mức độ bệnh ở cả 3 mặt của đoạn dây thanh long tại thời điểm 24 giờ, 72 giờ,
120 giờ và 168 giờ sau khi phun dịch lây nhiễm nấm Neoscytalidium dimidiatum.
Đánh giá tỉ lệ bệnh và chỉ số bệnh đốm nâu trên trụ thanh long như sau:
long điều tra) x 100
Chỉ số bệnh được tính theo cơng thức Townano Send- Heuberger:
Chỉ số bệnh (%) = 100 9 3 5 7 9 9 7 5 3 1 x N n n n n n
Trong đó: N: Tổng sốđoạn dây điều tra
Cấp bệnh Triệu chứng n1 n3 n5 n7 n9
1% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh < 10% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh < 25% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh < 50% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh
≥ 50% diện tích đoạn dây thanh long bị bệnh
Hiệu lực sinh học của vật liệu (%): được tính theo cơng thức Henderson- Tilton:
Hiệu lực (H), % = [1-(Ta x Cb)/(Tb x Ca)] x 100
Trong đó: Ta: Chỉ số bệnh ở cơng thức xử lý vật liệu sau lây nhiễm.
Tb: Chỉ số bệnh ở công thức xử lý thuốc trước lây nhiễm. Ca: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng sau lây nhiễm. Cb: Chỉ số bệnh ở công thức đối chứng trước lây nhiễm.
2.2.6. Nghiên cứu in vivo hiệu lực kiểm sốt bệnh đạo ơn lá và bạc lá lúa của vật