Chương 3 NI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊ NC U
3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C:U
3.4.1 Cách b& trí m=u
B ng 3.1 B trí s m u th t bị tươi t* nhà hàng qn ăn cho thí nghi m
Đa đi4m l!y m=u Qu n 1 Qu n 3 Qu n 5 Qu n 10 Qu n BT
S& lư2ng 20 20 20 20 20
T0ng 100
3.4.2 Phương pháp l!y m=u Cách l!y m=u
- M u th t bị tươi đư c l y t* các nhà hàng quán ăn ph i mang tính đ i di n cho ngu n th t ñư c sA d ng (các thao tác ph i vô trùng).
- Thao tác l y m u ph i ñúng theo TCVN 7046 – 2002.
V trí l y: l y t* 3 t i 5 v trí (m u ph i đư c l y m t cách ng u nhiên) trên ngu n th t và ph i mang tính đ i di n cho ngu n th t ñư c sA d ng t i các nhà hàng quán ăn.
− Cách b o qu n
M u sau khi ñư c l y ph i đ trong 2 l p bao nilon vơ trùng. Ký hi u m u, thông tin m u (ngu n g c, ngày, gi l y m u, nơi l y m)u,….. ) ñư c ghi lên gi y gAi m u. Gi y gAi m u ñ gi!a 2 l p bao nilon.
M u b o qu n trong thùng ñá tr! l nh # nhi t ñ 0-40 C và chuy n v phòng Vi Sinh - tr m Ch)n Đoán Xét Nghi m và Đi u Tr - Chi C c Thú Y Thành ph H
Chí Minh và ti"n hành xét nghi m trong vòng 24 gi .
3.4.3 Phương pháp xét nghi1m m=u th t bò tươi
Phương pháp xét nghi m m u ñư c th(c hi n theo quy trình c a Phịng Xét Nghi m Vi Sinh - Tr m Chu)n Đoán - Xét Nghi m Và Đi u Tr – Chi C c Thú Y Thành ph
25 gam th t
225ml nư c peptone ñ m
Đ pha loãng (10-1,10-2,10-3,10-4....) Đ pha loãng (10-1)
TSVSVHK E. coli Salmonella S. aureus
PCA Rapid E.coli Pepton ñ m BP
Đ"m t.ng s KL Đ"m t.ng s KL Rappaport 41,50C/24gi XLD Ch n KL nghi ng Th ch dinh dư ng NA
ThA sinh hoá thA kháng huy"t thanh
K"t lu n
Sơ đ) 3.1: Tóm t t quy trình xét nghi m vi sinh v t trong th t tươi
D p m u 370C/24gi 370C/24gi Ch n KL nghi ng và thA test (Staph Plus) Đ"m s KL 370C/24gi 440C/24gi 300C/72gi
3.4.2.1 T0ng s& vi khu5n hi/u khí
− Nguyên t c: ñ"m s khu)n l c m c trên môi trư ng th ch dinh dư ng t* m t lư ng m u xác ñnh trên cơ s# m i khu)n l c đư c hình thành t* m t t" bào vi sinh v t.
− Ti"n hành:
Pha loãng m u (nư c peptone ñ m), ch n 3 n ng đ liên ti"p (ví d : 10-4, 10-5, 10-6) tùy theo m c ñ v sinh d( ki"n m u, m i đ pha lỗng l y 1ml cho vào ñĩa petri r i thêm vào kho ng 15ml môi trư ng th ch dinh dư ng (PCA) đã vơ trùng.
Tr n ñ u b ng cách dùng tay xoay trịn đĩa xi và ngư c nhi u l n m t cách nh nhàng, sau đó đ đơng t( nhiên.
Sau đó l t úp ñĩa, và ñ trong t m # nhi t ñ 300C/72 gi
− Đ c k"t qu : ñ"m s khu)n l c m c trên các đĩa ni c y, ch n các đĩa có s
khu)n l c t* 15-300 (TCVN 7046 - 2002) đ tính giá tr trung bình c a các n ng ñ pha loãng và quy ra s lư ng vi khu)n có trong 1g m u.
M u(25g m u + 225ml dung d ch peptone ñ m)
Đ ng nh t m u
Ch n n ng ñ pha lỗng thích h p C y m u
Đ. dĩa môi trư ng PCA, m i n ng ñ 2 ñĩa trong 300C/ 72 gi
Đ c k"t qu (đ"m và tính t.ng s khu)n l c trên dĩa)
Sơ đ) 2.2 Quy trình xét nghi m vi khu)n hi"u khí theo TCVN 4884: 2005
Cách tính t0ng s& vi khu5n hi/u khí (TCVN 6404: 2007)
∑ C N =
Vx [n1+ (0,1 x n2)] xd
∑C t.ng các khu)n l c ñ"m ñư c trên t t c các ñĩa ñư c gi! l i t* 2 đ pha lỗng liên ti"p và trong đó ít nh t 1 đĩa ch a t i thi u 15 khu)n l c
n1 s dĩa c a đ pha lỗng th nh t ñư c gi! l i n2 s dĩa c a đ pha lỗng th hai ñư c gi! l i
d: h s pha lỗng tương ng v i đ pha lỗng th nh t đư c gi! l i Làm trịn k"t qu đã tính đ"n 2 ch! s có nghĩa
n: h s pha loãng theo b c(# các n ng đ pha lỗng theo b c 1,2,3) A, B, C s khu)n l c trung bình # m i n.ng đ pha loãng
3.4.2.2 Vi khu5n E. coli
− Nguyên t c: ñ"m s khu)n l c (màu tím ánh kim và màu ñ>) m c trên môi
trư ng chuyên bi t Rapid E. coli. − Ti"n hành:
+ Pha loãng m u (dùng nư c peptone ñ m), ch n # 3 n ng ñ liên ti"p thích h p (ví d 10-1, 10-2, 10-3) tuỳ theo m c ñ v sinh d( ki"n m u, m i đ pha lỗng l y 1ml cho vào ñĩa petri r i thêm vào kho ng 15ml
môi trư ng chuyên bi t Rapid’E. coli đã vơ trùng.
+ Tr n đ u b ng cách dùng tay xoay trịn đĩa xi và ngư c nhi u l n m t cách nh nhàng, đ đơng t( nhiên. Sau đó l t úp ñĩa, và ñ trong t m # nhi t ñ 440C/24 gi
+ Đ c k"t qu : đ"m khu)n l c có màu tím và đ>. Tính giá tr trung bình c a các n ng đ pha lỗng và quy ra s lư ng khu)n l c có trong 1g m u
M u(25g m u +225 ml dung d ch peptone ñ m (10-1)
Đ ng nh t m u
Pha loãng m u ch n n ng đ thích h p c y 1 ml dung d ch m u vào ñĩa petri
Cho 10-15 ml môi trư ng Rapid’s E.coli vào ñĩa petri
I 440C/ 24-48h
Đ c k"t qu
Cách tính t0ng s& Escherichia coli
∑ C N =
Vx [n1+ (0,1 x n2)] xd
∑C t.ng các khu)n l c ñ"m ñươc trên t t c các ñĩa ñư c gi! l i t* 2 đ pha lỗng liên ti"p và trong đó ít nh t 1 đĩa ch a t i thi u 15 khu)n l c
V: th tích d ch c y trên m i đĩa
n1 s dĩa c a đ pha lỗng th nh t ñư c gi! l i n2 s dĩa c a đ pha lỗng th hai ñư c gi! l i
d: h s pha loãng tương ng v i đ pha lỗng th nh t ñư c gi! l i Làm tròn k"t qu đã tính đ"n 2 ch! s có nghĩa
3.4.2.3 Vi khu5n Staphylococcus aureus
− Nguyên t c: Xác ñnh trên cơ s# thA ph n ng ngưng k"t t* khu)n l c ñ c trưng c a Staphylococcus aureus trên môi trư ng phân l p BP.
− Ti"n hành:
+ Pha loãng m u (nư c Peptone ñ m) # n ng ñ 10-1, l y 0,1 ml vào đĩa
petri có ch a mơi trư ng Baird Parker. Dàn ñ u trên b m t môi trư ng b ng que c y trang th y tinh vơ trùng.
+ Sau đó l t úp ñĩa và ñ t m # nhi t ñ 370C/24 gi – 48 gi
+ Đ"m s khu)n l c ch n khu)n l c ñ c trưng có màu đen nhánh, sáng trịn l i đư ng kính t* 1- 1,5mm đư c bao quanh b#i vịng sáng này.
+ Nh> 1 gi t thu c thA Staph Plus lên gi y thA. Dùng ñ u tăm vô trùng ch m vào khu)n l c thu n và hòa tan vào gi t thu c thA. Ph n ng (+) là ph n ng t o k"t t a l n c n.
M u (25g m u +225 ml dung d ch peptone ñêm )
Ch n n ng đ thích h p C y m u Môi trư ng BP, m i n ng ñ 2 ñĩa
370C/24 gi
Ch n khu)n l c đ c trưng (đen bóng, trịn, l i, có vịng sáng)
KhJng đnh b ng ph n ng ngưng k"t (Sta.plus)
Đ c k"t qu
Sơ đ) 2.4 Quy trình xét nghi m Staphylococcus aureus theo TCVN 4830- 1: 2005 Cơng th7c tính s& lư2ng vi khu5n Staphylococcus aureus: Cơng th7c tính s& lư2ng vi khu5n Staphylococcus aureus:
Tính lư ng a c a staphylococci có ph n ng dương tính v i coagulase đã nh n d ng trên m i ñĩa ñã ch n
a= bc/ Ac x Cc + bnc/ Anc x Cnc
Ac: s lư ng khu)n l c đi n hình đã qua phép thA coagulase
Anc: s lư ng khu)n l c khơng đi n hình đã qua phép thA coagulase
bc: s lư ng khu)n l c đi n hình cho th y có ph n ng dương tính v i coagulase bnc: s lư ng khu)n l c khơng đi n hình cho th y có ph n ng dương tính v i coagulase
Cc: t.ng s khu)n l c ñi n h-nh nhìn th y trên đĩa
Cnc: t.ng s khu)n l c đi n hình khơng nhìn th y trên đĩa
Cách tính s lư ng N staphylococci có ph n ng dương tính v i coagulase đã ñư c nh n d ng có m t trong ph n m u thA
∑ a N =
Vx [n1+ (0,1 x n2)] xd
∑a t.ng các khu)n l c staphylococci có ph n ng dương tính v i coagulase đã nh n bi"t trên t t c ñĩa ñã ch n
n1 s dĩa ñã ch n # ñ pha loãng th nh t n2 s dĩa ñã ch n # ñ pha loãng th hai
d đ pha lỗng tương ng v i dung d ch pha loãng th nh t ñã ch n ( huy n phù ban ñ u là m t đ pha lỗng)
Làm trịn k"t qu đã tính đ"n 2 ch! s có nghĩa
3.4.2.4 Vi khu5n Salmonella
− Nguyên t c: Salmonella sau khi ñư c tăng sinh sC ñư c xác đnh b ng mơi trư ng chun bi t XLD và các ph n ng sinh hóa.
− Ti"n hành:
+ Ti n tăng sinh: cân 25g m u + 225g nư c pepeptone ñ m, sau đó đưa
vào máy d p m u r i ñem 370C/24 gi .
+ Tăng sinh: l c k môi trư ng ti n tăng sinh trư c khi c y chuy n 1ml canh này vào môi trư ng tăng sinh (Rapaport Vassiliadis và nuôi # 370C/24 gi ).
+ Phân l p trên môi trư ng XLD: ch n khu)n l c đi n hình (trịn, hơi l i,
trong, đơi khi có tâm đen b khơng đ u).
+ ThA ph n ng sinh hóa: Salmonella đư c xác đnh là dương tính qua mơi trư ng TSI và các ph n ng sinh hoá khác: Lactose (-), Sucrose (-), Sinh H2S (+), Sinh hơi (+), Glucose (+), MR (+), VP (-); Urease(-); Indol(-); LDC(+)
M u(25g m u + 225ml dung d ch peptone ñêm)
Đ ng nh t m u 370C/24 gi
C y 0,1ml dung d ch m u + 10ml dung d ch Rappaport Vassiliadis 440C/24 gi
C y vào môi trư ng XLD 370C/24 gi Ch n khu)n l c đen, trịn, bóng
ThA sinh hóa:
TSI (Đ>/vàng), H2S(+), MR(+), VP(-), Indol(-), Urease(-), LDC(+)
ThA kháng huy"t thanh
Ghi k"t qu
Sơ đ) 2.5 Quy trình xét nghi m Salmonella theo TCVN 4829: 2005
Theo TCVN m u ñ t yêu c u là m u không phát hi n có Salmonella trong 25gram m u
3.5 X? LÝ S LI U
Phân tích ANOVA v i m u hồn tồn ng u nhiên 1 y"u t ñ i v i s khu)n l c trung bình/gam m u (các s li u đư c chuy n ñ.i sang logarit th p phân trư c khi xA lí th ng kê)
S m u ñ t tiêu chu)n v sinh
T, l m u ñ t = t.ng s m u ñ t/ t.ng s m u kh o sát x 100
Các t- l ñư c so sánh b ng tr c nghi m χ2 (sA d ng ph n m m Minitab)
Chương 4
K T QU TH O LU N
4.1 Ki4m tra vi sinh trên th t bò tươi
4.1.1 Ch: tiêu t0ng s& vi khu5n hi/u khí (TSVKHK) 4.1.1.1 K/t qu TSVKHK trên th t bò tươi
S lư ng vi khu)n hi"u khí/ 1g m u th t kh o sát, đư c trình bày # b ng 4.2. (S li u ñã ñư c quy ñ.i ra logarit trư c khi tính tốn th ng kê).
B ng 4.1 K"t qu t.ng s vi khu)n hi"u khí/1g th t kh o sát
Ghi chú: là s trung bình tính b ng logarit; TB là s trung bình th(c
Qua k"t qu trình bày b ng 4.1 chúng tơi nh n th y:
T.ng s vi khu)n hi"u khí trung bình trên m u kh o sát là 4,64 x 106 khu)n l c/gam, s khu)n l c bi"n thiên t* 1,79 x 106 khu)n l c/gam ñ"n 9,5 x 106 khu)n l c/gam.
S lư ng vi khu)n hi"u khí/ g có trong các m u th t ñư c l y # các nhà hàng quán
ăn trong t*ng khu v(c qu n kh o sát: qu n 1 là 4,16x 106, # khu v(c qu n 3 là 2,80 x 106, khu v(c qu n 5 là 1,79x 106, khu v(c qu n 10 là 4,90x 106, khu v(c qu n Bình Th nh là 9,47x 106. Đa đi m l y m u S m u kh o sát TB (x106) Qu n 1 20 4,16 6,6 Qu n 3 20 2,80 6,4 Qu n 5 20 1,79 6,2 Qu n 10 20 4,90 6,7 Qu n Bình Th nh 20 9,47 6,9 T.ng 100 4,64 6.56
T* k"t qu trên, chúng tôi nh n th y các m u th t có ngu n g c t* các nhà hàng quán ăn thu c khu v(c qu n Bình Th nh nhi+m t.ng s vi khu)n hi"u khí là cao nh t, k" ñ"n là các nhà hàng thu c qu n 10, và nhi+m th p nh t là các nhà hàng thu c ña bàn qu n 5, nhưng s( khác bi t này khơng có ý nghĩa th ng kê (P> 0,05).
4.2.1.2 T: l1 m=u th t bò tươi ñ$t yêu c+u v9 ch: tiêu t0ng s& vi khu5n hi/u khí.
T- l m u th t bị tươi ñ t yêu c u ch- tiêu t.ng s vi khu)n hi"u khí đư c trình bày qua b ng 4.2 và ñư c minh ho v i bi u ñ 4.1
B ng 4.2: T- l m u ñ t yêu c u v ch- tiêu t.ng s vi khu)n hi"u khí
Đ a ñi4m l!y m=u S& m=u kh o sát S& m=u ñ$t T@ l1 ñ$t (%)
Qu#n 1 20 4 20 Qu#n 3 20 5 25 Qu#n 5 20 8 40 Qu#n 10 20 3 15 Qu#n Bình Th$nh 20 2 10 T0ng 100 22 22 t@ l1 ñ$t (%) Qu n 1 Qu n 3 Qu n 5 Qu n 10 Qu n Bình Th nh T.ng đa đi4m
Bi4u đ) 4.1: T- l m u ñ t yêu c u v ch- tiêu t.ng s vi khu)n hi"u khí
Theo TCVN 7046 – 2002 quy ñnh ch- tiêu t.ng s vi khu)n hi"u khí là dư i 106 khu)n l c/gam. K"t qu b ng 4.3 cho ta th y t- l m u th t bò tươi ñư c l y t* các nhà
Trong ñó các nhà hàng quán ăn thu c qu n Bình Th nh có t, l đ t th p nh t (10%) và các nhà hàng quán ăn thu c qu n 5 có t, l đ t cao nh t (40%). T, l m u ñ t yêu c u c a các qu n ñư c kh o sát khơng có ý nghĩa v m t th ng kê (P> 0,05).
Theo kh o sát c a Tr n Thúy Di+m (2007) t, l m u th tươi ñ t yêu c u v TSVKHK c a các nhà hàng quán ăn thu c qu n 1 là 41% và c a qu n 5 là 18%, k"t qu mà chúng tôi kh o sát # qu n 1 là 20% và # qu n 5 là 40%. Đi u này có th th y tình hình an tồn th(c ph)m # qu n 1 đư c quan tâm đúng m c và có chi u hư ng đi xu ng, cịn # qu n 5 thì tinh hình này đang đư c c i thi n rõ ràng.
T, l m u th tươi ñ t yêu c u v TSVKHK c a qu n 10, qu n 3 theo khào sát c a Dương Hoàng Kha (2005) l n lươt là 26,7% và 33,3%, so v i k"t qu chúng tôi kh o sát # qu n 10 là 15% và qu n 3 là 25% thì k"t qu c a chúng tơi th p hơn.
So v i k"t qu kh o sát c a Bùi Vân Anh (2005) t i m t s nhà hàng quán ăn thu c ña bàn qu n Binh Th nh v t, l m u ñ t yêu c u TSVKHK thì k"t qu c a chúng tôi th p hơn (k"t qu c a Bùi Vân Anh (2005) là 72,5% cịn c a chúng tơi là 10%).
Đi u này cho th y tình tr ng nhi m vi khu)n c a thit tươi ñư c sA d ng trong các nhà hàng quán ăn th t ñáng lo ng i, k"t qu này ñã nói lên r ng v n đ an tồn v sinh th(c ph)m trong các nhà hàng quán ăn ngày nay chưa ñư c quan tâm ñúng m c. T, l ñ t chung cho các qu n theo kh o sát c a chúng tôi l 22%, t, l này th p hơn so v i t, l ñư c Bùi Vân Anh kh o sát trong năm 2005 (65,8%) và b ng v i t, l kh o sát c a Tr n Thúy Di+m trong năm 2007 (22%). Nguyên nhân có th do:
V n đ v sinh trong q trình b o qu n và ñi u ki n b o qu n th t tươi (0- 40) #
các nh hàng quán ăn chưa ñư c ñ m b o và chưa đúng u c u. Chính đi u này ñã
t o ñi u ki n cho vi sinh v t phát tri n trong qua trình bào qu n và làm gi m ph)m ch t cũa thit tươi ñư c sA d ng trong các nhà hàng quán ăn.
Ngu n g c cung c p th t tươi cho các nhà hàng quán ăn chưa ñ m b o v v sinh trong quá trình v n chuy n, gi"t m. và bày bán
Do tay ngư i mua bán, trao ñ.i, ti"p xúc.. v i ngu n th t ñư c sA d ng trong nhà hàng quán ăn.
Hình 4.1 Khu)n l c vi khu)n hi"u khí trên mơi trư ng PCA (khu)n l c màu tr ng)
4.1.2 Ch: tiêu E. coli trên th t bò tươi 4.1.2.1 S& lư2ng vi khu5n E. coli 4.1.2.1 S& lư2ng vi khu5n E. coli
S lư ng trung bình vi khu)n E. coli nhi+m trên th t tươi đư c trình bày qua b ng