STT Ký hiệu Nguồn thu thập STT Ký hiệu Nguồn thu thập
1 2 Mỹ 27 102 Nhật 2 3 Mỹ 28 106 Nhật 3 9 Mỹ 29 107 Nhật 4 17 Pháp 30 110 Mỹ 5 18 Pháp 31 111 Mỹ 6 20 Pháp 32 117 Mỹ 7 28 Nga 33 118 Mỹ 8 41 Pháp 34 120 Mỹ 9 58 Pháp 35 121 Mỹ 10 59 Pháp 36 124 Mỹ 11 71 Pháp 37 125 Mỹ 12 73 Pháp 38 128 Mỹ 13 75 Pháp 39 129 Mỹ 14 76 Pháp 40 130 Mỹ 15 77 Nhậ 41 131 Mỹ 16 78 Nhật 42 132 Mỹ 17 79 Nhật 43 134 Mỹ 18 80 Nhật 44 138 Mỹ 19 82 Nhật 45 141 Mỹ 20 84 Nhật 46 142 Mỹ 21 89 Nhật 47 143 Mỹ 22 91 Nhật 48 146 Mỹ 23 94 Nhật 49 154 Mỹ 24 95 Nhật 50 157 Mỹ 25 98 Nhật 51 HT7 (đC) Việt Nam 26 101 Nhật
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
28
3.1.2. địa ựiểm và thời gian nghiên cứu
Các nghiên cứu ựược thực hiện tại phòng nghiên cứu Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng và khu thắ nghiệm đồng ruộng khoa Công nghệ sinh học - Trường đại học nông nghiệp Hà Nội, Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội trong thời gian từ 22/09/2010 ựến tháng 07/2011.
3.2. Nội dung nghiên cứu
- Thắ nghiệm 1: khảo sát một số đặc điểm nơng sinh học, năng suất, chất lượng quả, khả năng kháng virus trên ựồng ruộng của các mẫu giống cà chua nhập nội trong vụ đơng xuân 2011.
- Thắ nghiệm 2: phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá trong tập đồn các mẫu giống bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi P6-25F2/R5.
- Thắ nghiệm 3: phát hiện gen chắn chậm rin trong tập đồn các mẫu giống bằng phương pháp PCR sử dụng cặp mồi C43F/R.
- Thắ nghiệm 4: đánh giá đặc tắnh chắn chậm của quả của các mẫu giống mang gen chắn chậm rin (phát hiện nhờ PCR) và so sánh với một số mẫu giống không mang gen rin.
- Thắ nghiệm 5: khảo sát một số ựặc ựiểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả, khả năng kháng virus trên ựồng ruộng của một số mẫu giống tốt trong vụ xuân hè muộn 2011.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Các thắ nghiệm khảo sát đánh giá tập đồn cà chua
Bố trắ thắ nghiệm
- Thắ nghiệm khảo sát tập đồn cà chua được bố trắ theo kiểu tuần tự một hàng không nhắc lại, mỗi mẫu giống trồng 20 câỵ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
29
- đông xuân: gieo ngày 21/9/2010, trồng ngày 21/10/2010 - Xuân hè muộn: gieo ngày 25/2/2011, trồng ngày 26/3/ 2011
Kỹ thuật trồng và chăm sóc: Áp dụng theo hướng dẫn trong tiêu chuẩn ngành 10TCN219: 2006 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (Bộ NN và PTNT, 2006).
- Giai ựoạn vườn ươm: hạt giống ựược gieo trên giá thể gồm trấu hun và ựất bột theo tỷ lệ 1:1. Hạt ựược gieo trong khay bầu, tưới phun mù ựủ ẩm, ựặt trong nhà có mái chẹ Hàng ngày chăm sóc, tưới nước và giữ ẩm cho câỵ Khi cây con ựược 5-6 lá thì trồng.
- Giai ựoạn trồng ở ruộng sản xuất:
+ Chọn đất, lên luống: thắ nghiệm được bố trắ trên ựất trồng lúa, lên luống cao 25 cm, mặt luống rộng 1 m, rãnh rộng 50 cm.
+ Mật ựộ 2.67 vạn cây/ha, trồng 2 hàng/luống, cây x cây 50 cm, hàng x hàng 65 cm. + Lượng phân bón cho 1 ha: 20 tấn phân hữu cơ,100kg N, 100kg P2O5, 100kg K2Ọ Bón lót tồn bộ phân hữu cơ, tồn bộ phân lân, 1/3 phân đạm và 1/3 kalị Lượng ựạm và kali cịn lại chia đều bón thúc vào 3 lần xới vun.
+ Tưới nước: sau khi trồng cần tưới nước giữ ẩm cho ựất khoảng 75% + Vun xới, làm cỏ: vun xới kết hợp bón thúc lần 1 sau trồng 30 ngày, lần 2 khi sau trồng 60 ngày, lần 3 sau trồng 80 ngàỵ Thường xuyên nhổ bỏ cỏ dạị
+ Làm giàn hình chữ A khi cây cao 30 - 40 cm
+ Tỉa cành: đối với giống vơ hạn tỉa bỏ cành phụ, chỉ để lại 2 thân chắnh. + Phòng trừ sâu bệnh hại: theo dõi và phòng trừ bệnh xoăn vàng lá, mốc sương, héo xanh vi khuẩn bằng thuốc Daconil, Zinep; phòng trừ sâu cắt lá, sâu xám, sâu vẽ bùa, sâu xanh, sâu ựục quả bằng thuốc Sherpạ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
30
vào đặc điểm chắn của giống.
Các chỉ tiêu theo dõi: áp dụng theo hướng dẫn trong tiêu chuẩn ngành
10TCN219: 2006 (Bộ NN và PTNT, 2006) và 10TCN557-2002 (Bộ NN và PTNT, 2002). - Các giai ựoạn sinh trưởng:
- Thời gian từ trồng ựến ra hoa: khi 50% số cây trong ơ thắ nghiệm có hoa ựầu tiên. - Thời gian từ trồng ựến thu quả ựợt 1: khi 50% số cây theo dõi có quả chắn. - Thời gian từ trồng ựến kết thúc thu hoạch: tắnh đến ngày thu hết quả thương phẩm. - Một số chỉ tiêu về cấu trúc cây và hình thái lá:
- Kiểu hình sinh trưởng: quan sát đặc tắnh ra hoa và sinh trưởng của cây vào giai ựoạn ra hoa: kiểu hữu hạn, khi cây ra hoa rộ thân chắnh ngừng sinh trưởng; kiểu vơ hạn, cây ra hoa thân chắnh vẫn tiếp tục sinh trưởng và kiểu bán hữu hạn, trung gian giữa hai kiểu trên.
+Mức ựộ xanh của lá: quan sát màu mặt trên phiến lá khi thu hoạch lứa quả thứ 2-3, các mức: xanh ựậm, xanh, xanh sáng.
+ Dạng lá: quan sát sự phân thùy của lá chét thời kỳ thu hoạch lứa quả thứ 2 - 3, gồm dạng lá bình thường và dạng lá khoai tâỵ
+ Số ựốt từ gốc tới chùm hoa thứ nhất: theo dõi thời kỳ ra chùm hoa thứ 2 - 3. + Chiều cao từ gốc tới chùm hoa thứ nhất: ựo từ cổ rễ ựến chùm hoa 1, theo dõi thời kỳ ra chùm hoa 2 - 3.
+ Chiều cao thân chắnh: đo từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng, giai ựoạn kết thúc thu hoạch.
- Cấu trúc chùm hoa và ựặc ựiểm nở hoa
+ Kiểu chùm hoa: ựơn giản - hoa ra trên một nhánh chắnh; trung gian - hoa ra trên 2 nhánh chắnh; phức tạp - chùm hoa chia thành nhiều nhánh.
+ Số hoa/chùm: số hoa nở của 5 chùm ựầu tiên trên 3 cây thời kỳ hoa rộ, lấy trung bình.
+ đặc ựiểm nở hoa: quan sát và phân ra nở hoa rộ tập trung hay nở hoa rải rác. - Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
31
+ Tỷ lệ ựậu quả: ựếm số quả ựậu của 5 chùm hoa ựầu tiên của 3 cây vào thời kỳ kết thúc ựâụ quả ựể xác ựịnh tỷ lệ ựậu quả trên từng chùm và tỷ lệ ựậu quả trung bình, gồm các mức: rất thấp (dưới 10%), thấp (10 - 20%), trung bình (21- 40%), cao (41 - 60%) và rất cao (trên 60%).
+Tổng số quả/cây: tổng số quả các lần thu/cây, theo dõi 5 cây, lấy trung bình. + Khối lượng trung bình quả: tổng khối lượng của số quả ựiều tra/số quả. + Năng suất cá thể (khối lượng quả/cây): tổng khối lượng quả thu ựược/cây, theo dõi 5 cây, tắnh trung bình.
- đặc điểm hình thái và chất lượng quả:
+ đường kắnh quả (độ lớn quả): đo đường kắnh quả ở phần lớn nhất của 10 quả chắn thuộc lứa quả thứ 2 hoặc 3 ựể xác ựịnh ựộ lớn của quả.
+ Chiều cao quả (H): bổ dọc quả, ựo chiều cao từ ựỉnh ựến ựáy quả của 10 quả chắn, chùm quả 2-3.
+ Chỉ số hình dạng quả: I = H/ D, dựa vào chỉ số hình dạng quả để phân biệt các dạng quả: dạng quả dẹt (I < 0.6), tròn dẹt (0.6 < I < 0.9), tròn (0.9 < I < 1.1), tròn dài (1,3 > I >1,1) và dài (I > 1,3).
+ Số ngăn hạt/ quả: bổ ngang quả ựếm số ngăn hạt của 5 quả, lấy trung bình. + độ chắc quả: dùng tay nắn khi quả chắn hồn tồn, chùm quả 2-3. Gồm các mức: mềm, trung bình, cứng.
+ Mức ựộ xanh của quả: quan sát màu phần ựáy quả xanh của chùm quả 2 - 3, mô tả mức ựộ: xanh nhạt, xanh, xanh ựậm.
+ Màu sắc vai quả xanh: quan sát sự khác nhau về màu xanh vai quả so với phần còn lại của quả trưởng thành lứa quả 2-3, mơ tả mức độ: khơng đổi, xanh nhạt, trung bình, xanh ựậm.
+Màu sắc quả chắn: quan sát màu quả của chùm quả thứ 2 - 3 khi chắn hồn tồn. + đánh giá hương vị quả: có hay khơng hương vị thơm ựặc trưng của cà chua hoặc có hương vị phụ khác (hăng, ngái).
+ độ Brix%: đo khi quả chắn hồn tồn (dùng khúc xạ kế), lấy ngẫu nhiên quả của lứa 2-3 của 5 cây mẫu, phân tắch chậm nhất sau thu hoạch 3 ngày, các mức:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
32
thấp (dưới 3,5%), trung bình (3,6-4,4%), cao (4,5 - 6,0%), rất cao (trên 6%).
+ Khẩu vị (*): ựánh giá cảm quan theo các mức: chua, chua dịu, nhạt, ngọt dịu, ngọt, ngọt ựậm.
+ độ ướt thịt quả (*): dùng dao sắc cắt ngang quả và phân biệt: ướt - mặt thịt quả ướt, khơng có dịch quả chảy ra; khơ nhẹ - mặt thịt quả lấm tấm dịch quả; khô - mặt thịt quả ráo nước.
(*): theo hướng dẫn của trung tâm nghiên cứu và phát triển giống rau chất lượng cao, đại học Nông nghiệp Hà Nội
- đánh giá tình hình nhiễm một số sâu bệnh hại chắnh trên đồng ruộng: bệnh mốc sương và héo xanh ựược ựánh giá theo tiêu chuẩn ngành 10TCN219: 2006 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn (bộ NN và PTNT), bệnh xoăn vàng lá ựược ựánh giá theo chỉ số mức ựộ nghiêm trọng bệnh (Lapidot và Friedmann, 2002).
+ Bệnh mốc sương (Phytophthora infestans): ựánh giá sau trồng 30, 60 và 90 ngày theo thang ựiểm từ 0 ựến 5:
[0] Không bệnh
[1] Dưới 20% diện tắch thân lá nhiễm bệnh [2] Từ 20-50% diện tắch thân lá nhiễm bệnh [3] Từ 50-75% diện tắch thân lá nhiễm bệnh [4] Từ 75-100% diện tắch thân lá nhiễm bệnh
+ Bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacerum Smith): theo dõi từ trồng đến thu hoạch, đếm số cây có triệu chứng bệnh, tắnh tỷ lệ% cây bệnh.
+ Bệnh virus xoăn vàng lá: theo dõi từ trồng ựến kết thúc thu hoạch, ựánh giá theo chỉ số mức ựộ nghiêm trọng bệnh từ 0 ựến 4:
[0] không thấy xuất hiện các triệu chứng bệnh; [1] vàng rất nhẹ ở mép lá chét trên lá ựỉnh; [2] biến vàng nhẹ và ựỉnh lá chét cuốn nhẹ;
[3] một loạt các lá vàng, xoăn, và cong hình thìa nhưng cây vẫn tiếp tục phát triển; [4] các cây cây còi cọc rất nặng, lá vàng, xoăn, và cong hình thìa rất rõ, cây
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
33
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
34
3.3.2. Nghiên cứu phát hiện gen Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá và gen chắn chậm rin
Chiết xuất DNA
DNA ựược chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle và Doyle, 1990), được cải tiến bởi bộ mơn CNSH ứng dụng, Khoa Cơng nghệ sinh học, Trường đại học Nơng nghiệp Hà Nộị
- Hóa chất và đệm:
+ DEB (DNA Extraction Buffer): 2% CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β - Mercaptoethanol. Hịa tan CTAB và các hóa chất khác trong nước cất 2 lần bằng cách ủ trong waterbath ở 65oC. Thêm 2 % β-Mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng.
+ TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0.
+ Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform: isoamyl alcohol (24:1), 100 % ethanol, 76 % ethanol.
- Qui trình chiết xuất DNA:
+ Thu các lá non vào buổi sáng, ựặt trên ựá lạnh và đưa về phịng thắ nghiệm càng sớm càng tốt.
+ Cắt khoảng 100 mg mô lá vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 400 ộl DEB, tiếp tục thêm 400 ộl DEB và trộn ựều trước khi chuyển hỗn hợp vào tuble 1,5 ml. đưa ngay các tube vào ủ ở 65oC trước khi chuyển sang nghiền mẫu khác.
+ Ủ mẫu ở 65ỨC trong 1 giờ hoặc hơn. Ủ lâu hơn kết quả năng suất DNA pellet cao hơn, sạch hơn, trắng hơn (Aldrich và Cullis, 1993).
+ Chiết xuất với cùng thể tắch 25:24:1 (1:1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách ựảo ngược các ống trong 5 phút, sau đó ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phịng, 12000 rpm ựể phân tách các pha, chuyển pha lỏng phắa trên sang một tube 1,5 ml mớị Từ bước này tránh vortex, hút ựi hút lại ựặc biệt qua các đầu pipet thể tắch nhỏ, và bất cứ
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
35
thao tác nào gây ra lực cơ học ựể tránh gây ựứt gẫy DNA (Herzer, 2001).
+ Chiết với cùng thể tắch 24:1, trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp rồi lật ngửa (inverting) tubes trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phịng, 12000 rpm, chuyển pha lỏng phắa trên sang 1 tube mớị
+ Tủa DNA với 2 - 2,5 lần thể ethanol lạnh 100 % sao cho nồng ựộ làm việc khoảng 70%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì đặt mẫu ở - 20oC trong khoảng 20Ỗ ựến 2 tiếng hoặc qua ựêm nếu thấy cần thiết (Herzer, 2001).
+ Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt độ phịng trong 5 phút, tốc độ 12000 rpm. + đổ bỏ cồn, rửa pellet hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB. CTAB đã được hịa tan trong ethanol, số cịn lại được loại bỏ trong bước này (Aldrich và Cullis, 1993). Làm khơ pellet trong khơng khắ khoảng 1h và hịa tan trong 50 ộl TẸ
+ Kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA bằng ựiện di trên gel agarose 1% ở hiệu ựiện thế 100V trong khoảng 15 phút. độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức ựộ ựứt gãy và nồng ựộ DNA tổng số.
Chạy PCR phát hiện gen Ty-3 sử dụng cặp mồi P6-25F2/R5
- Trình tự cặp mồi P6-25F2/R5 (Ji và cộng sự, 2007c):
+ P6-25-F2: 5Ỗ- GGT AGT GGA AAT GAT GCT GCT C - 3Ỗ
+ P6-25-R5: 5Ỗ- GCT CTG CCT ATT GTC CCA TAT ATA ACC - 3Ỗ
- Phản ứng PCR ựược tiến hành trong thể tắch 25 ộl gồm 2.5 ộl 2.5 mM hỗn hợp 4 loại dNTP, 5 ộl 5x buffer, 2.5 ộl 2.5 mM MgCl2, 0.1 ộl (0.5 units) GoTaq DNA polymerase, 2.5 ộl mỗi mồi xuôi và ngược nồng độ 10 ộM, 2-5 ộl DNA khn, và nước cất.
- Chu kỳ nhiệt: 94oC trong 4 phút, 35 chu kỳ gồm 94oC trong 30 s, 53oC trong 1 phút, và 72oC trong 1 phút, sau các chu kỳ này là bước kéo dài ở 72oC trong 10 phút, sau đó phản ứng được giữ ở 4oC.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ
36
gel agarose 1.5% trong ựệm TAE 1 X, nhuộm với ethidium bromide và hiển thị dưới ánh sáng UV.
Chạy PCR phát hiện gen chắn chậm rin sử dụng cặp mồi C43F/R
- Trình tự cặp mồi C43F/R (Vrebalov và cộng sự, 2002)
+ C43F: 5Ỗ- GAC GGG AAC CAT TAG ATT TTA AAG ACA - 3Ỗ
+ C43R: 5Ỗ- GTG TTA TCA ATA TTG CCA TAC TCT TCT TGA CAA - 3Ỗ - Phản ứng PCR ựược tiến hành trong tổng thể tắch 25 ộl gồm: 2.5 ộl 2.5 mM hỗn hợp 4 loại dNTP, 5 ộl 5x buffer, 2.5 ộl 2.5 mM MgCl2, 0.1 ộl (0.5 units) GoTaq DNA polymerase, 2.5 ộl mỗi mồi xi và ngược nồng độ 10 ộM, 2-5 ộl DNA khuôn, và nước cất.
- Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: 940C trong 3 phút, 39 chu kỳ gồm 940C trong 1 phút, 560C trong 1 phút, 720C trong 30 giây, kết thúc bằng bước kéo dài ở 720C trong 5 phút.
- Các mảnh khuếch đại bằng PCR sau đó được phân tách bằng ựiện di trên gel agarose 2% trong ựệm TAE 1 X, nhuộm với ethidium bromide và hiển thị dưới ánh sáng UV.
3.3.3. đánh giá đặc tắnh chắn chậm của các mẫu giống mang gen chắn chậm rin