Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Các bước tiến hành xét nghiệm
2.3.1. Hóa chất và dụng cụ
- Dung dịch PBS để pha loãng tinh dịch (nếu mật độ tinh trùng ≥ 15 triệu/ml).
- Dung dịch ly giải: 0,5 - 5,0M DTT; 2 - 4M NaCl; 0,1 - 0,4M Tris; 0,01 - 0,1M NaOH.
- Dung dịch biến tính acid HCl 30 - 37%. - Ethanol 70 - 100%.
- Dung dịch Giemsa 5 - 30%. - Thạch agarose.
- Nước cất.
- Bộ xét nghiệm Halosperm (Halotech, Tây Ban Nha)
Dụng cụ: Lam kính, lamen, micropipet, pipet, đầu cơn, khay ngâm lam
kính, lị vi sóng, tủ lạnh, kính hiển vi độ phóng đại 40x, máy đếm tế bào, găng tay cao su...
2.3.2. Chuẩn bị mẫu
Mẫu tinh dịch được lấy vào lọ đựng tinh dịch bằng phương pháp thủ dâm sau 2 - 7 ngày không xuất tinh, bảo quản ở nhiệt độ thường trong vòng 4 tiếng và 4oC trong vịng 24 giờ.
2.3.3. Quy trình xét nghiệm đứt gãy DNA tinh trùng
Bước 1. Chuẩn bị thạch: Đun cách thủy eppendorf chứa agarose pha sẵn
ở nhiệt độ 95 - 100o C 5 phút hoặc trong lị vi sóng 3 phút, cho đến khi hóa lỏng hồn tồn agarose. Pha lỗng mẫu tinh dịch bằng dung dịch PBS sao cho nồng độ khoảng < 15 triệu tinh trùng/ml tinh dịch. Giữ ống agarose ở nhiệt độ 37oC trong vòng 5 phút đến khi nhiệt độ trong eppendorf chứa thạch và nhiệt độ trong bể ủ nhiệt được cân bằng.
Bước 2. Chuẩn bị hỗn hợp tinh dịch - thạch: cho 25 µl tinh dịch vào ống
agarose và trộn đều bằng pipet. Giữ ống ở nhiệt độ 37oC và nhanh chóng thực hiện bước kế tiếp, tránh agarose bị đơng. Nhỏ một giọt 25µl hỗn hợp tinh dịch
- thạch lên vị trí được khoanh trịn trên lam kính, đậy lamen, ấn nhẹ, tránh bọt khí xuất hiện. Lam kính được đặt nằm ngang trong suốt q trình thao tác. Đặt tiêu bản vào tủ lạnh 4oC, trong 10 phút để agarose đông lại.
Bước 3. Sau khi hỗn hợp tinh dịch - thạch đông lại, lấy tiêu bản ra khỏi
tủ lạnh, bỏ lamen bằng cách trượt nhẹ ra.
Chuẩn bị dung dịch biến tính và làm biến tính DNA tinh trùng: lấy 80µl dung dịch biến tính cho vào ống đựng 10ml nước cất, lắc đều sẽ được dung dịch biến tính cần thiết. Đặt tiêu bản vào khay chứa dung dịch biến tính trong vòng 7 phút.
Bước 4. Ly giải tế bào: lấy tiêu bản từ dung dịch biến tính và đặt vào khay chứa 10 ml dung dịch ly giải trong 5 phút.
Bước 5. Rửa dung dịch ly giải: sau khi kết thúc bước ly giải, đặt tiêu bản
vào khay chứa nước cất trong 5 phút để rửa dung dịch ly giải.
Bước 6. Khử nước: khử nước bằng cách cho tiêu bản vào dung dịch cồn
100% trong vịng 6 phút, sau đó để khơ tự nhiên.
Bước 7. Nhuộm tiêu bản: đặt tiêu bản nằm ngang, nhỏ dung dịch Giemsa
5% phủ lên trên bề mặt tiêu bản, để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút rồi rửa qua nước từ vòi, chú ý tránh rửa quá mạnh làm nhạt màu quầng halo.
- Chứng dương: tế bào tinh trùng khơng có quầng. Thực hiện theo các bước thí nghiệm từ 1 đến 2. Thêm 50 μl H2O2 (300μM) phủ lên toàn bộ bề mặt tiêu bản. Ủ trong 5 phút trong tủ lạnh, giữ lam ở vị trí nằm ngang. Sau đó tiếp tục các bước tiếp theo của xét nghiệm.
- Chứng âm: tế bào tinh trùng có quầng. Thực hiện theo các bước của quy trình, bỏ qua bước 4.
2.3.4. Đánh giá kết quả
Quan sát lam kính dưới kính hiển vi quang học, đếm ít nhất 500 tinh trùng có đi trong tinh dịch để xác định độ đứt gãy DNA tinh trùng. Xác
định bằng quầng halo của tinh trùng theo Fernandez và cộng sự (hình 2.2) [53]. Độ đứt gãy DNA tinh trùng được tính theo cơng thức sau:
DFI=TT c ó h alo n h ỏ+TT k h ơ ng c ó h alo+TT t h o á ihó a
T ổ ng s ố TT đ ế m đ ư ợ c ×100 %
Hình 2.2. Hình ảnh tinh trùng có quần halo và khơng có quầng halo [53].
(1) Tinh trùng có quầng halo lớn (Big halo): Kích thước quầng halo ≥ đường kính ngang của nhân (a ≥ b)
(2) Tinh trùng có quầng halo vừa (Medium halo): 1/3 đường kính ngang của nhân < kích thước quầng halo < đường kính ngang của nhân
(1/3b < a < b).
(3) Tinh trùng có quầng halo nhỏ (Small halo): Kích thước quầng halo ≤ 1/3 đường kính ngang của nhân (a ≤ 1/3b).
(4) Tinh trùng khơng có quầng halo (Without halo).
(5) Tinh trùng thối hóa (Degraded): Tinh trùng có nhân bắt màu kém, khơng đều.