Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Các bước tiến hành nghiên cứu
2.4.1. Hồn thiện quy trình pha chế bộ xét nghiệm xác định đứt gãy DNA tinh trùng.
2.4.1.1. Tối ưu hóa nồng độ thạch agarose để tạo hỗn hợp với mẫu tinh dịch
Tại 5 eppendorf chứa 70µl thạch agarose (bằng thể tích thạch của bộ xét nghiệm thương mại Halosperm) pha ở 5 nồng độ khác nhau là 0,5%; 0,7%; 0,9%; 1,2%; 1,5%; chúng tôi thực hiện hết bước 2 của xét nghiệm bằng cách trộn thêm 25µl tinh dịch rồi cho 25µl hỗn hợp tinh dịch - thạch lên lam kính của bộ xét nghiệm thương mại Halosperm, phủ lamen, đặt ở nhiệt độ 4oC. Sau 10 phút, chúng tôi bỏ lamen, tiến hành so sánh bề mặt thạch sau khi đông giữa các nồng độ trên và với thạch của bộ xét nghiệm thương mại Halosperm, từ đó lựa chọn nồng độ thạch tối ưu đảm bảo xét nghiệm.
2.4.1.2. Tối ưu hóa lam kính
Lam kính sử dụng trong xét nghiệm xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng cần là lam kính thủy tinh được phủ một lớp mỏng thạch agarose. Trên lam kính thủy tinh thơng thường sản xuất tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành xử lý bằng 5 loại dung dịch thạch agarose có nồng độ khác nhau từ 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9%. Các bước xử lý như sau:
- Chuẩn bị các dung dịch thạch, đun sơi đến khi thạch tan hồn tồn thì hạ nhiệt, giữ ở 45oC.
- Nhúng lam kính vào dung dịch thạch trong thời gian 1 phút. - Đặt lam kính ở 2 - 8oC trong 50 phút.
- Ủ khô ở nhiệt độ 37oC cho đến khi thạch trên lam kính khơ hồn tồn. Tại 5 lam kính đã được xử lý bằng các nồng độ thạch khác nhau như ở trên, chúng tôi cũng thực hiện bước 1 và 2 của xét nghiệm. Sau đó, chúng tơi
cũng so sánh bề mặt thạch sau khi đơng giữa các lam kính trên, nhằm lựa chọn ra nồng độ thạch phủ lam kính tối ưu.
2.4.1.3. Tối ưu hóa nồng độ dung dịch biến tính và ly giải
Tối ưu hóa nồng độ dung dịch biến tính
Nồng độ hóa chất dùng để biến tính DNA tinh trùng: HCl 30 - 37%. Dựa trên kết quả của một cộng sự trong nhóm nghiên cứu [54], chúng tơi lựa chọn nồng độ HCl phù hợp là 30% và thực hiện tối ưu tại nồng độ này bằng cách tiến hành xét nghiệm trên 50 mẫu tinh dịch song song vừa bằng dung dịch biến tính của bộ xét nghiệm thương mại Halosperm vừa bằng dung dịch HCl 30%. Sau xét nghiệm, chúng tôi so sánh kết quả giữa 2 nhóm trên.
Tối ưu hóa nồng độ dung dịch ly giải
Nồng độ hóa chất dùng ly giải: 0,5 - 5,0 M DTT; 2 - 4 M NaCl; 0,1 - 0,4 M Tris; 0,5 - 2% Triton X - 100.
Cũng dựa trên kết quả của một cộng sự trong nhóm nghiên cứu [54], chúng tôi lựa chọn nồng độ dung dịch ly giải phù hợp (0,5 M DTT; 2,5 M NaCl; 0,2 M Tris; 1% Triton X - 100) và thực hiện tối ưu tại nồng độ này bằng cách tiến hành xét nghiệm trên 50 mẫu tinh dịch song song vừa bằng dung dịch ly giải của bộ xét nghiệm thương mại Halosperm vừa bằng dung dịch ly giải tự pha. Sau xét nghiệm, chúng tôi so sánh kết quả giữa 2 nhóm trên.
2.4.1.4. Hồn thiện quy trình sản xuất bộ xét nghiệm xác định mức độ đứt gẫy DNA tinh trùng
Sau khi thử nghiệm và hồn thiện quy trình trên 50 mẫu bệnh nhân, chúng tơi tiến hành xác định độ chính xác của bộ xét nghiệm tự pha.
Độ chụm được xác định thông qua 3 đại lượng:
- Độ lặp lại
Cùng một phịng thí nghiệm ở Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.
Cùng một kỹ thuật viên. Cùng một khoảng thời gian.
- Độ chụm trung gian (intermediate precision)
Làm xét nghiệm tại 2 thời điểm khác nhau trong vòng 24 giờ, bảo quản mẫu tinh dịch ở 4oC.
Với kỹ thuật viên khác nhau. Với các dụng cụ khác nhau.
- Độ tái lập (reproducibility)
Phịng thí nghiệm tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội và Học viện Quân Y.
Thay đổi phương pháp.
Chúng tôi sử dụng bộ xét nghiệm tự pha tiến hành xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng lặp lại 10 lần. Tính độ lệch chuẩn SD và hệ số biến thiên CV% theo công thức sau với yêu cầu CV ≤ 5%.
Trong đó: SD: độ lệch chuẩn n: số lần thí nghiệm
xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i” : Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm RSD%: Độ lệch chuẩn tương đối
Độ đúng
Trên một mẫu tinh dịch, chúng tôi sử dụng bộ xét nghiệm tự pha tiến hành xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng lặp lại 10 lần. Do bệnh phẩm là tinh dịch khơng có mẫu chuẩn, chúng tơi lấy giá trị được chấp nhận đúng là kết quả của bộ xét nghiệm đạt chuẩn IVD Halosperm, từ đó tính ttn theo công thức sau và so sánh với tc [50].
2.4.2. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm xác định đứt gãy DNA tinh trùng và đánh giá tương đương kết quả của bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại
Chuẩn bị 300 mẫu tinh dịch. Trên mỗi mẫu tinh dịch, chúng tôi tiến hành xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng 2 lần, một lần bằng bộ xét nghiệm tự pha, một lần bằng bộ xét nghiệm thương mại.
Bảng 2.1. Bảng quy ước xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm. Bộ xét nghiệm tự pha
DFI > 15% DFI ≤ 15% Bộ xét nghiệm
thương mại
DFI > 15% Dương tính thật Âm tính giả DFI ≤ 15% Dương tính giả Âm tính thật
2.4.2.1. Xác định độ nhạy của bộ xét nghiệm
Độ nhạy (%) được tính theo cơng thức:
Đ ộ nh ạ y= D ư ơng tínhth ậ t
D ương tính th ậ t+Âm tính gi ả×100 % 2.4.2.2. Xác định độ đặc hiệu của bộ xét nghiệm
Cũng từ kết quả trên, độ đặc hiệu (%) được tính theo cơng thức:
Đ ộ đ ặ c hi ệ u= Âm tính th ậ t
Âm tính th ật+D ư ơng tính gi ả×100 %
2.4.2.3. So sánh tương đương bộ xét nghiệm tự pha và bộ xét nghiệm thương mại
Trên cùng một mẫu tinh dịch, chúng tôi tiến hành xác định mức độ đứt gãy DNA tinh trùng 2 lần: 1 lần bằng bộ xét nghiệm ngoại nhập và 1 lần bằng bộ xét nghiệm tự pha chế. Khác biệt giữa 2 phương pháp được khảo sát dựa vào : phân tích tương quan Pearson, T - test và biểu đồ Bland - Altman [55].