Thuyết minh quy trình:
Cam Hà Giang đƣợc thu hái ở giai đoạn 212 – 221 ngày sau khi đậu quả, khối lƣợng không nhỏ hơn 0,15 kg. Biểu hiện bên ngồi là: vỏ có màu xanh hơi bóng, hơi vàng nhạt. Phần vỏ xốp có màu hơi vàng. Chính giữa đáy trái xuất hiện đốm trịn (đƣờng kính khoảng 1,5-2cm) vị chua ngọt hài hòa. Dùng dao hoặc kéo cắt sát cuống rồi cho vào túi vải hoặc giỏ, sọt có lót giấy hoặc rơm để tránh xây xƣớc. Không nên thu hái khi trời nắng nóng, vì lúc này nhiệt độ cao, quả hô hấp mạnh làm giảm chất lƣợng cam và hiệu quả bảo quản. Sau cơn mƣa hoặc lúc sƣơng mù chƣa tan hết cũng không nên thu hái cam để tránh bị nấm bệnh xâm nhập gây thối quả. Sau khi thu hái, cần lựa chọn những quả tƣơi, đồng đều về hình thức, kích thƣớc, khơng bị sâu bệnh, vỏ quả khơng có các vết sần sùi, chai cứng để đem bảo quản.
Cam sau thu hoạch
Lựa chọn/Phân loại
Rửa sạch Nhúng quả vào chế phẩm BQC Để khô Để khơ Đóng thùng Bảo quản
Rửa quả bằng nƣớc sạch tránh tác động cơ học quá mạnh để loại bỏ các vi sinh vật bám trên vỏ quả. Sau đó quả đƣợc để khơ tự nhiên 80-90% giúp tăng khả năng bám chế phẩm khi xử lý và tránh pha loãng dung dịch
Xử lý bảo quản cam bằng nhúng một lần trong thời gian 1 phút vào chế phẩm có nồng độ 94-100%. Sau đó tiến hành để khơ tự nhiên 20 - 30 phút, đảm bảo cố định chế phẩm BQC trên quả.
Quả sau xử lý đặt lên khay, bảo quản trong hộp cacton sạch có đục lỗ để trao đổi khí và ẩm ở điều kiện nhiệt độ thƣờng. Xuất kho sau khi quả đạt các chỉ tiêu theo dõi và đƣợc đánh giá cảm quan tốt.
Ƣu điểm của chế phẩm chứa tinh dầu nghệ vàng BQC trong bảo quản cam
- Dễ sử dụng do yêu cầu kỹ thật đơn giản, khơng u cầu nhân lực trình độ cao - Thân thiện với mơi trƣờng và an tồn
- Có thể phối chế vào màng các hợp chất theo ý muốn
- Dễ dàng cơ giới hóa khâu sử dụng nhƣ trong hệ thống xƣởng sơ chế - Chế phẩm có thể triển khai với quy mô lớn
Nhƣợc điểm khi sử dụng chế phẩm bảo quản ở những ngày đầu cam sẽ có mùi nghệ thoang thoảng nhƣng sẽ hết trong thời gian bảo quản. Ngoài ra, chế phẩm nên đƣợc pha chế với tinh dầu nghệ trƣớc khi bắt đầu bảo quản, không nên pha chế sẵn sẽ giảm hoạt tính của các thành phần trong tinh dầu nghệ.
3.6 Nghiên cứu tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ
3.6.1 Đánh giá khả năng ức chế sinh trƣởng nấm da của tinh dầu nghệ vàng
Đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh trên da của tinh dầu nghệ bằng phƣơng pháp khuếch tán trên đĩa thạch. Các chủng nấm đƣợc phân lập từ nguồn bệnh tại Viện Da Liễu Trung Ƣơng và tiến hành cấy bào tử nấm mốc, sinh khối nấm men với mật độ khoảng 108 CFU/ml trên mơi trƣờng sabourand. Tấm giấy lọc có đƣờng kính 5 mm đã khử trùng. Lấy 20µl tinh dầu nghệ vàng thơ thấm vào giấy lọc và đặt lên đĩa thạch có cấy vi sinh vật thử nghiệm. Tƣơng tự nhƣ vậy, chuẩn bị tấm giấy lọc có kháng sinh tiêu chuẩn chứa
gentamycin 80μg và 10μg của streptomycin vô trùng làm đối chứng dƣơng để so sánh hoạt tính đối kháng nấm của tinh dầu nghệ. Các đĩa petri đƣợc ủ ở 300C trong 36 giờ. Kết quả thu đƣợc nhƣ trên bảng 3.28
Bảng 3. 28: Hoạt tính kháng nấm da của tinh dầu nghệ vàng
Chủng vi sinh vật Đƣờng kính vịng kháng (D-d),cm
Tinh dầu nghệ vàng Gentamycin Streptomycin
Candida albicans 2,5 ± 0,07 1,35 ± 0,05 1,5 ± 0,15
Trychophytol mentargrohytes
2,0 ± 0,23 1,1 ± 0,04 1,3 ± 0,01
Kết quả trên cho thấy, tinh dầu nghệ vàng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên da rất tốt [148]. Tinh dầu thô cho đƣờng kính vịng kháng khuẩn 2,5 cm đối với Candida albicans và 2,0 cm đối với Trychophytol mentargrophytes, cao hơn so với 2 loại kháng
sinh đối chứng. Kết quả này cũng tƣơng tự với kết quả của Valero và cộng sự cho rằng các loại tinh dầu có nguồn gốc từ nhiều loài thực vật có hoạt tính kháng nấm da tốt [135]. Nhiều loại tinh dầu đã đƣợc thử nghiệm in vitro và in vivo cho thấy hoạt tính kháng nấm có thể đƣợc khai thác nhƣ thuốc kháng nấm tiềm năng [77]. Cơ chế hoạt động của tinh dầu tác động chủ yếu lên màng tế bào nấm, phá vỡ cấu trúc màng, ngăn chặn sự tổng hợp màng tế bào, ức chế sự nảy mầm bào tử, sự phát triển nấm và hô hấp tế bào [66, 67]. Sharma và cộng sự đã nghiên cứu thuốc thảo dƣợc có chứa bột thân rễ nghệ vàng chữa khỏi bệnh nấm ngoài da gây ra bởi Trychophyton verrucosum cho 12 con gia súc và Microsporum canis
cho 21 con chó trong vòng 12-15 ngày điều trị [122].
Ảnh hƣởng của các nồng độ tinh dầu nghệ vàng khác nhau tới sinh trƣởng của hai loại nấm nghiên cứu đã đƣợc xác định (bảng 3.29)
Bảng 3. 29: Ảnh hưởng nồng độ tinh dầu nghệ vàng lên sinh trưởng các chủng nấm da nghiên cứu
Nồng độ tinh dầu (%) Đƣờng kính đối kháng (D-d), mm
Candida albicans Trychophytol mentargrohytes
0 0,0 0,0 0,3 0,3 ± 0,37 0,2 ± 0,11 0,5 1,6 ± 0,28 0,9 ± 0,18 0,7 1,7 ± 0,54 1,4 ± 0,15 1,0 1,8 ± 0,32 1,6 ± 0,18 1,5 2,2 ± 0,58 1,9 ± 0,08 2,0 2,6 ± 0,71 2,2 ± 0,13 2,5 3,0 ± 1,73 2,6 ± 0,11 3,0 3,3 ± 1,03 3,1 ± 0,17
Tin đã bắt đầu thể hiện hoạt tính ức chế sinh trƣởng của Candida albicans, và Trychophytol mentargrohytes nhƣng không rõ ràng,
đƣờng kính vịng kháng nấm nhỏ và rất mờ. Theo nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, kh không chỉ tinh dầu nghệ vàng, mà tinh dầu một số loại nhƣ tỏi, đinh hƣơng, quế…đều tăng theo sự tăng của n [76]. Kết quả bảng 3.29 nhận đƣợc cho thấy, nồng độ ức chế tối thiểu của tinh dầu nghệ thu đƣợc bằng phƣơng pháp LCHN là 0,5% cho Candida albicans và 0,7% cho Trychophytol mentargrohytes [148]. Kết quả này cũng tƣơng tự của Wuthi-udomlert và cộng sự đánh giá
hoạt tính đối kháng nấm da của tinh dầu nghệ [139]. Điều này cho thấy việc sử dụng tinh dầu nghệ trong việc điều trị nhiễm nấm da là rất khả quan và đã có một số nghiên cứu tiền lâm sàng đƣợc tiến hành với thuốc mỡ có chứa tinh dầu của Trachyspermum ammi [70] và
Curcuma longa [40].
3.6.2 da của tinh dầu nghệ vàng
Để xác định thời gian tối thiểu tinh dầu nghệ có thể tiêu diệt hoàn toàn các chủng nấm nghiên cứu, thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: các chủng nấm đƣợc nuôi trong môi trƣờng lỏng mật độ 108
CFU/ml, bổ sung tinh dầu nghệ vàng nồng độ 0,5 % cho C. albicans và 0,7% cho T. mentagrophyte. Sau các khoảng thời gian nhất định, cấy trải 20 µl canh trƣờng ni lên đĩa petri có mơi trƣờng sabouraud. Xác định số khuẩn lạc phát triển (bảng 3.30).
Bảng 3. 30: Ảnh hưởng của thời gian phơi nhiễm lên khả năng diệt nấm của tinh dầu nghệ vàng
khuẩn lạc (CFU/ml) Thời gian( phút) Candida albicans Trychophytol mentargrohytes 0 8,6.103 7,48.103 5 5,36. 103 5,54.103 10 2,96. 103 3,36.103 15 2,08. 103 3.103 20 1,76. 103 2,52.103 25 1,48. 103 1,92.103 30 0,2. 103 0,84.103 45 0,12. 103 0,56.103
60 0 0,4.103
90 0 0
120 0 0
Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.30 và hình 3. 36, 3.37 đối với 2 chủng nấm gây bệnh trên da C. albicans và T. mentagrophytes cho C. albicans bị tiêu diệt hoàn toàn sau 1 giờ ủ với tinh dầu nghệ, và T. mentagrophytes chịu đƣợc tác động của tinh dầu nghệ tốt hơn. Loài này chỉ bị tiêu diệt hoàn toàn sau 90 phút ủ với tinh dầu nghệ.
Một số nghiên cứu đánh giá hoạt tính và cơ chế của tinh dầu tác động đến nấm da nhƣ Pintovà cộng sự thấy rằng tinh dầu Thymus pulegioides nồng độ 0,08 µg/ml làm giảm hàm lƣợng ergosterol của loài T. rubrum xuống 70% [107]. Cơ chế hoạt động dựa trên suy giảm sinh tổng hợp ergosterol đã đƣợc giả thuyết nhƣ với thuốc kháng nấm azole [76]. Inouye và cộng sự bằng kính hiển vi điện tử quan sát thấy tinh dầu phá hủy màng tế bào và thành tế bào phụ thuộc vào nồng độ và thời gian tiếp xúc [71]. Park đã phân tích cơ chế hoạt động của eugenol, một hợp chất chính trong tinh dầu Syzygium aromaticum với loài T.
mentagrophytes và quan sát thấy sự phá hủy màng ty thể bên trong, vách tế bào, mạng
lƣới nội chất gần màng tế bào. Đây là cơ chế tác động thông qua sự thay đổi cấu trúc tế bào ở màng [102, 104]. Bajpai và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm bào tử của các loài T. rubrum, M. canis, T. mentagrophytes với tinh dầu Nandina domestica cho thấy hiệu quả
tác động rất mạnh và cũng phụ thuộc rất nhiều vào thời gian tiếp xúc [40].
Với các kết quả thu được khi đánh giá hoạt tính kháng nấm của tinh dầu nghệ vàng bằng LCHN cho thấy tinh dầu nghệ vàng là chất có tiềm năng có thể thay thế chất kháng sinh trong điều trị bệnh nấm da và chất bảo quản trong chế phẩm sinh học. Khả năng ức chế sự phát triển của tinh dầu nghệ vàng với loài C. albicans cao hơn T. mentagrophytes.
3.6.3 Nghiên cứu xây dựng quy trình tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng nghệ vàng
Hiện nay thƣờng sử dụng thuốc diệt nấm tổng hợp để kiểm soát các bệnh nấm trên da. Nhƣng do việc sử dụng thời gian dài các loại thuốc này trong những thập niên qua đã phá vỡ hệ thống kiểm sốt sinh học tự nhiên, đơi khi dẫn đến sự phát triển của các loài nấm kháng thuốc hoặc thuốc có tác dụng khơng mong muốn lên các sinh vật có lợi. Do đó, việc phát triển các loại chế phẩm mới để kiểm soát các bệnh nấm này là vần đề cần thiết và cấp bách.
3.6.3.1 Lựa chọn các thành phần chính trong chế phẩm chăm sóc da
Chế phẩm chăm sóc da thƣờng có dạng lotion, dạng sữa, dạng kem mềm, kem cứng, đƣợc sử dụng cho tất cả các loại da từ da khô, da nhờn, da trƣởng thành đến da nhạy cảm. Tùy theo nhu cầu và mục đích sử dụng mà nhà sản xuất tạo ra từng loại sản phẩm khác nhau. Trong đó, kem là dạng bào chế phổ biến nhất trong thuốc da liễu cũng nhƣ trong mỹ
phẩm thông thƣờng ở dạng nhũ tƣơng và khơng có tính hút giữ nhiều, nên kem đƣợc khuyến cáo sử dụng trong các bệnh da bán cấp [65].
Căn cứ quyết định 48/2007/QĐ-BYT do Bộ Y tế ban hành “ Quy chế quản lý mỹ phẩm” ngày 31/12/2007; hiệp định về hệ thống hòa hợp ASEAN về quản lý mỹ phẩm ngày 2/9/2003 và quyết định 2063/BYT-QĐ ngày 4/11/1996 về hàng hóa bắt buộc đăng ký chất lƣợng tại Bộ Y tế quy định thành phần đƣợc sử dụng và không đƣợc sử dụng trong chế phẩm mỹ phẩm, khi đƣa ra thị trƣờng phải đảm bảo u cầu về an tồn khơng ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Dựa vào các tài liệu và các qui định sử dụng các chất trong mỹ phẩm, thành phần trong kem chăm sóc da thƣờng có:
- Hệ nhũ tƣơng đƣợc tạo bởi cetylalcol và acid stearic khoảng 3%. Đây là chất nhũ hóa anionic, thƣờng dùng cho các loại kem, lotion và thuốc mỡ O/W. Đặc biệt tốt cho các chế phẩm bôi trên da [65, 72].
- Chất làm mềm: trong chế phẩm chăm sóc da thƣờng sử dụng dầu khống trắng giúp da căng mịn và nhẵn bóng. Đồng thời dầu khoáng trắng cũng là thành phần chính trong pha dầu của chế phẩm chiếm 5-10% khối lƣợng. Theo tài liệu tham khảo hàm lƣợng trong chế phẩm chăm sóc da là thƣờng bổ sung 6% [65, 69].
- Chất hoạt động bề mặt: Chất hoạt động bề mặt có vai trị là chất nhũ hóa quyết định độ bền của nhũ tƣơng thƣờng chiếm 0,5-5% khối lƣợng. Nhiều chất hoạt động bề mặt không ion nhƣ tween-80, polyethylene glycol 1000, monocetyether…thƣờng đƣợc sử dụng. Tuy nhiên, chế phẩm có tinh dầu nghệ vàng là hợp chất khơng tan trong nƣớc vì vậy chúng tơi lựa chọn tween-80 là chất hoạt động bề mặt đồng thời cũng tăng khả năng khuyếch tán của tinh dầu với hàm lƣợng phối trộn là 1% [65, 72].
- Chất giữ ẩm: Sản phẩm phải hút ẩm từ khơng khí, duy trì ở điều kiện ẩm thƣờng, hàm lƣợng nƣớc ít thay đổi theo độ ẩm tƣơng đối, chất làm ẩm có độ nhớt thấp, dễ trộn vào sản phẩm, tuy nhiên chất có độ nhớt cao giúp ngăn ngừa sự tách rời nhũ tƣơng, màu, mùi, vị thích hợp, khơng độc và khơng kích ứng, khơng gây ăn mịn đối với vật liệu bao gói, khơng bay hơi, khơng đóng rắn hay kết tinh ở nhiệt độ thơng thƣờng, trung tính trong các phản ứng. Các hợp chất thƣờng đƣợc sử dụng nhất cho mục đích hút ẩm trong sản phẩm mỹ phẩm chăm sóc da là: glycerine, ethylen glycol, propylen glycol, glycerol, sorbitol, polyethylene glycol.... chiếm 1-5%. Trong đó, glycerin đƣợc sử dụng phổ biến có nồng độ 3% [65, 90, 93].
- Chất làm đặc đƣợc sử dụng làm đặc dung dịch và tạo độ nhớt với hiệu quả cao, dễ sử dụng khi phối chế vào sản phẩm, chống tái bám bẩn trở lại, tạo cảm quan tốt cho sản
metyl cellulose (CMC), Hydroxyethyl cellulose (HEC), Carbomer…Trong đó đƣợc dùng phổ biến nhất là Carbomer 940 do tính năng làm đặc tốt, cho độ nhớt cao, hút nƣớc và ngậm nƣớc tốt, chống tái bám bẩn cao chiếm 0.1-1% khối lƣợng. Theo patent WO 2010/063155 A1 carbomer 940 có nồng độ 0,2% [65].
- Chất kháng khuẩn và chống nấm: Đây là chất có khả năng ức chế và ngăn ngừa sự phát triển của vi khuẩn, bào tử nấm gây bệnh. Từ thế kỷ 18 khi phát hiện ra tinh dầu ngƣời ta đã biết sử dụng để diệt côn trùng và dùng làm chất hỗ trợ bảo quản. Hàm lƣợng tinh dầu sử dụng bổ sung vào chế phẩm thƣờng từ 0,002-10% hay từ 0,01%-5% [73, 93]. Với kết quả đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu nghệ vàng cho thấy có thể sử dụng tinh dầu này vừa là chất bảo quản đồng thời là chất diệt nấm thay thế chất diệt nấm tổng hợp hiện nay đang dùng trong điều trị là rất khả quan [79]. Hàm lƣợng tinh dầu ức chế sự phát triển của 2 chủng nấm nghiên cứu là 0,7% vì vậy nồng độ này cũng đƣợc chọn này để phối trộn tạo chế phẩm [69].
- Chất chống oxi hóa: Có nhiều chất có khả năng chống oxy hóa nhƣ beta-carotene, lycopene, selenium, và các vitamin A, C và E,..có tác dụng chống tổn thƣơng tế bào từ các gốc tự do. Hàm lƣợng bổ sung thƣờng từ 0,05-1% khối lƣợng. Theo patent WO 1989005137 vitamin E đƣợc sử dụng phổ biến với hàm lƣợng 0,4%[93].
- Chất điều chỉnh pH: Độ pH của da là một lớp “áo giáp” bảo vệ, là một màng phim mỏng trên da giúp cho da đƣợc lành mạnh, chống lại các tác nhân ô nhiễm, tác hại của thời tiết, nhiễm vi khuẩn và nấm. Với các sản phẩm tẩy rửa, pH khoảng 5,5. Để chống sự lão hóa da, pH=3,5 hoặc cao hơn. Đối với các sản phẩm tẩy tế bào chết và kích thích tái tạo tế bào, độ pH tối ƣu ở khoảng 4. Tuy nhiên, độ pH trong chế phẩm cịn ảnh hƣởng đến tính ổn định của hệ nhũ tƣơng và chất bảo quản sử dung trong chế phẩm để khơng gây kích ứng da và theo tham khảo pH trong mỹ phẩm thƣờng từ 6,5-7.
Bảng 3. 31: Thành phần chế phẩm chăm sóc da
STT Thành phần nguyên liệu Khối lƣợng (%)
1 Cetyl alcohol 1 2 Acid Stearic 3 3 Dầu khoáng 6 4 Carbomer 940 0,2 5 Glycerin 3 6 Tween-80 1 7 Tinh dầu nghệ vàng (TDNV) 0,7
8 Vitamin E 0,4
9 NaOH 0,02
10 Nƣớc tinh khiết 84
3.6.3.2 Quy trình tạo chế phẩm chăm sóc da có chứa tinh dầu nghệ vàng