2.1 Đối tượng nghiên cứu:
Gồm 131 bệnh nhân điều trị tại khoa Ung Bướu – Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh từ 5/2017 đến 5/2018 chia làm 3 nhóm:
Nhóm I: Bệnh phổi lành tính 41 bệnh nhân
Nhóm II: Ung thư phổi tế bào không nhỏ (UTP - TBKN) 47 bệnh nhân.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn:
Tất cả 131 bệnh nhân nhập viện tại khoa Ung Bướu - Bệnh viện Đa khoa tỉnh Quảng Ninh từ tháng 5/2017 đến tháng 5/2018 được lựa chọn ngẫu nhiên. Tất cả đối tượng được xét nghiệm máu, chức năng gan, thận và kiểm tra X-quang ngực chấp thuận đồng ý nghiên cứu. Nhóm bệnh phổi lành tính gồm 41 bệnh nhân sau khi đã có chẩn đốn bị viêm phổi, tràn dịch màng phổi, giãn phế quản và chẩn đoán áp xe phổi và được đánh giá theo Hướng dẫn thực hành lâm sàng NCCN trong phòng chống ung thư phổi phiên bản 2.2013 [15], [21]. Nhóm những bệnh nhân bị ung thư phổi bao gồm 47 trường hợp ung thư phổi tế bào không nhỏ và 43 trường hợp ung thư phổi tế bào nhỏ. Những bệnh nhân này được chẩn đốn bằng sinh thiết mơ theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới năm 2004 [10]. Tất cả các mẫu được thu thập trước khi điều trị.
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:
Bệnh nhân từ chối không tham gia nghiên cứu.
Không phải bệnh nhân ung thư phổi.
Bệnh nhân ung thư phổi có kèm suy thận, bệnh gan thận và tim mạch.
Không đủ hồ sơ và thông tin bệnh án ở thời điểm kết thúc nghiên cứu.
Không tuân thủ các qui định trong q trình nghiên cứu.
2.2 Vật liệu, hóa chất nghiên cứu
Hóa chất và vật liệu của hãng Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Đức
2.2.1 Vật liệu
- CalSet: Pro-GRP, CEA, NSE và CYFRA 21-1
- PreciControl: Pro-GRP thẻ mã vạch, tờ mã vạch mẫu chuẩn, 4 chai trống có nhãn và nắp bật, 2 x 6 nhãn chai
- PreciControl Tumor Marker CEA, NSE, CYFRA 21-1 thẻ mã vạch, tờ mã vạch mẫu chuẩn, 4 chai trống có nhãn và nắp bật, 2 x 6 nhãn chai
- Nước cất hay nước khử ion
- Máy phân tích xét nghiệm miễn dịch Cobas e601 – hãng Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Đức và hộp thuốc thử xét nghiệm.
- ProCell M, 2 x 2 L dung dịch đệm
- CleanCell M, 2 x 2 L dung dịch rửa buồng đo
- PC/CC‑Cups, 12 cốc để làm ấm ProCell M và CleanCell M trước khi sử dụng
- ProbeWash M, 12 x 70 mL dung dịch rửa dùng sau khi chạy mẫu xong và khi thay đổi thuốc thử
- PreClean M, 5 x 600 mL dung dịch rửa hỗn hợp phản ứng
- AssayTip/AssayCup Combimagazine M, 48 khay x 84 cốc phản ứng hay đầu pipette, túi đựng rác
- WasteLiner, túi đựng rác
- Adapter M cho SysClean Các phụ kiện chung cho tất cả máy phân tích: - ISE Cleaning Solution/Elecsys SysClean, 5 x 100 mL dung dịch rửa hệ thống
2.2.2 Hóa chất
Hóa chất chuẩn
- Pro-GRP, NSE, CEA, CYFRA 21-1 Cal1: 2 chai, mỗi chai 1.0 mL mẫu chuẩn 1
- Pro-GRP, NSE, CEA, CYFRA 21-1 Cal2: 2 chai, mỗi chai 1.0 mL mẫu chuẩn 2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
(khoảng 20 pg/mL và khoảng 294 pg/mL) trong huyết thanh ngựa; chất bảo quản.
- NSE (người) với hai khoảng nồng độ (khoảng 0.5 ng/mL và khoảng 50 ng/mL) trong hỗn hợp đệm/protein (albumin huyết thanh bò), natri azide.
- CEA (người, từ canh cấy tế bào) với hai khoảng nồng độ (khoảng 5 ng/mL và khoảng 50 ng/mL) trong hỗn hợp đệm/protein 1 ng/mL CEA tương ứng với 16.9 mIU/mL.
- CYFRA 21-1 (người, từ dòng tế bào MCF-7) với hai khoảng nồng độ (khoảng 0 ng/mL và khoảng 50 ng/mL) trong huyết thanh người. Hóa chất kiểm tra
- Pro-GRP (tái tổ hợp từ E. coli) với hai khoảng nồng độ (khoảng 40 pg/mL và khoảng 650 pg/mL) trong huyết thanh người.
PC Pro-GRP 1: 2 chai, mỗi chai 1.0 mL huyết thanh chứng
PC Pro-GRP 2: 2 chai, mỗi chai 1.0 mL huyết thanh chứng
- PreciControl Tumor Marker CEA, NSE, CYFRA 21-1 là huyết thanh chứng đông khô lấy từ huyết thanh người. Các nồng độ nằm trong hai khoảng có liên quan trên lâm sàng. Mẫu chứng được dùng để kiểm tra độ đúng và độ chính xác của các xét nghiệm miễn dịch Elecsys.
PC TM1: 2 chai, mỗi chai 3.0 mL huyết thanh chứng (người)
PC TM2: 2 chai, mỗi chai 3.0 mL huyết thanh chứng (người) Bộ thuốc thử được dán nhãn Pro-GRP
- Vi hạt phủ Streptavidin (nắp trong), 1 chai, 6.5 mL: Vi hạt phủ Streptavidin 0.72 mg/mL; chất bảo quản.
- R1 Anti-Pro-GRP-Ab~biotin (nắp xám), 1 chai, 9 mL: Kháng thể đơn dòng kháng Pro-GRP đánh dấu biotin (chuột) 3.5 mg/L; đệm phosphate 40 mmol/L, pH 7.0; chất bảo quản.
đơn dòng kháng Pro-GRP (chuột) đánh dấu phức hợp ruthenium 2.0 mg/L; đệm phosphate 40 mmol/L, pH 7.0; chất bảo quản.
Bộ thuốc thử được dán nhãn NSE.
- Các vi hạt được phủ Streptavidin (nắp trong suốt), 1 chai, 6,5 mL: Các vi hạt được phủ Streptavidin 0,72 mg/mL; chất bảo quản.
- R1 Anti-NSE-Ab ~ biotin (nắp màu xám), 1 chai, 10 mL: Kháng thể đơn dòng kháng biotin 18E5 (chuột) 1,0 mg/L, đệm phosphate 50 mmol / L, pH 7,2; chất bảo quản.
- R2 Anti-NSE-Ab ~ Ru (bpy) (nắp đen), 1 chai, 10 mL: Kháng thể đơn dòng 84B10 (chuột) được dán nhãn với phức hợp ruthenium 1,0 mg / L; dung dịch đệm phosphate 50 mmol/L, pH 7,2; chất bảo quản. Bộ thuốc thử được dán nhãn CEA.
- Các vi hạt được phủ Streptavidin (nắp trong suốt), 1 chai, 8 mL: Các vi hạt được phủ Streptavidin 0,72 mg/mL; chất bảo quản.
- R1 Anti-CEA-Ab ~ biotin (nắp màu xám), 1 chai, 10 mL: Biotatinated đơn dòng kháng ‑ CEA (chuột / người) 3.0 mg / L; dung dịch đệm phosphate 100 mmol/L, pH 6.0; chất bảo quản.
- R2 Anti-CEA-Ab~Ru (bpy) (nắp đen), 1 chai, 8 mL: Kháng thể đơn dòng kháng chuột (CEA) được dán nhãn ruthenium phức tạp 4,0 mg/L; dung dịch đệm phosphate 100 mmol/L, pH 6,5; chất bảo quản. Bộ thuốc thử được dán nhãn CYFRA 21-1
- Vi hạt phủ Streptavidin (nắp trong), 1 chai, 6.5 mL: Vi hạt phủ Streptavidin 0.72 mg/mL; chất bảo quản.
- R1 Anti-cytokeratin 19-Ab~biotin (nắp xám), 1 chai, 10 mL: Kháng thể đơn dòng kháng cytokeratin 19 đánh dấu biotin (KS 19.1; chuột) 1.5 mg/L; đệm phosphate 100 mmol/L, pH 7.2; chất bảo quản.
- R2 Anti-cytokeratin 19-Ab~Ru(bpy) (nắp đen), 1 chai, 10 mL: Kháng thể đơn dòng kháng cytokeratin 19 (BM 19.21; chuột) đánh dấu phức
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
hợp ruthenium 2 mg/L; đệm phosphate 100 mmol/L, pH 7.2; chất bảo quản.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp mô tả tiến cứu và có đối chứng. Các số liệu được ghi nhận và phân tích theo trình tự ngẫu nhiên.
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm
Tuổi: chia đối tượng nghiên cứu theo 4 nhóm tuổi:
≤ 40 tuổi
Từ 41-60 tuổi
Từ 61 – 80 tuổi
≥ 81 tuổi
Giới: nam, nữ.
Thói quen: hút thuốc, khơng hút thuốc
Các triệu chứng hay gặp tại thời điểm chẩn đoán.
2.3.2 Phương pháp lấy mẫu bệnh phẩm
Tất cả đối tượng nghiên cứu được thực hiện lấy mẫu bệnh phẩm.
Lấy máu vào buổi sáng, chưa ăn uống gì.
Máu được lấy từ tĩnh mạch khuỷu tay.
Số lượng 2mL vào ống chống đông bằng Liti heparin. Đối với NSE bắt buộc lấy vào ống Serum.
Ly tâm 4000 vòng /5 phút, tách huyết tương;
Loại bỏ những mẫu huyết tán, lipid, bilirubin cao. Xét nghiệm huyết tương được làm ngay trong vòng 2h, nếu chưa làm ngay thì được bảo quản huyết tương hoặc huyết thanh ở tủ âm (-20°C).
2.3.3 Phương pháp xác định nồng độ các marker sinh hóa
- Nồng độ của các dấu ấn khối u được phân tích sau khi chẩn đốn và trước khi điều trị. Đối với tất cả các mẫu huyết thanh, nồng độ Pro-GRP, CEA, NSE và CYFRA21-1 trong huyết thanh được đo bằng máy phân tích miễn dịch tự động Cobas e601 (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Đức).
- Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lấy tiêu chuẩn lâm sàng là trị số cắt của các dấu ấn khối u. Trị số cắt của CEA là 5 ng/mL, CYFRA21-1 là 3,3 ng/mL, NSE là 13 ng/mL và Pro-GRP là 50 pg/mL. Là giới hạn trên của tính quy phạm, các giá trị ngưỡng này đã được áp dụng trong lâm sàng trong nhiều năm.
2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu
Phân tích thống kê được thực hiện với SPSS cho Windows (phiên bản 22.0) và MedCalc (phiên bản 15.2.2). Dữ liệu được biểu thị dưới dạng dải trung vị và giữa các vùng (IQR). Tỷ lệ mắc các loại bệnh lý khác nhau được tính là phân số trong nghiên cứu này. Các biến liên tục được kiểm tra bằng phép thử Kruskal - Wallis và Mann - Whitney U. Các thử nghiệm chính xác Chi-bình phương và Fisher được sử dụng để so sánh dữ liệu phân loại và khoảng tin cậy của tỷ lệ được tính tốn bằng phương pháp Wald (tiệm cận).
Trung vị (Median – Me)
Sau khi xác định trị số cắt (Cut off value) ta có thể tính.
Cách tính độ nhạy (Se%), độ đặc hiệu (Sp%), giá trị tiên đoán dương (PPV) và giá trị tiên đoán âm (NPV) theo bảng sau:
Bệnh Test
Có Bệnh Khơng mắc bệnh
Dương tính (PPV) A ( Dương tính thật ) B ( Dương tính giả ) Âm tính (NPV) C ( Âm tính giả ) D ( Âm tính thật )
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Giá trị tiên đoán dương (PPV):
Cụ thể như sau:
Có ý nghĩa thống kê: p <0.05: độ tin cậy 95% p<0,01: độ tin cậy 99% p<0,001: độ tin cậy 99,9%
Khơng có ý nghĩa thống kê: p>0,05 (độ tin cậy 95%)
Đánh giá mối tương quan: Dựa trên hệ số tương quan R.
Cách tính độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của các xét nghiệm nghiên cứu.
ROC (Receiver Operating Characteristic): Diện tích dưới đường cong.
Sử dụng đường cong ROC mục đích.
1. Tìm ngưỡng tối ưu (Cut off value) trị số cắt để cho giá trị độ nhạy (Se%), độ đặc hiệu (Sp%) tốt nhất cho chẩn đoán bệnh của xét nghiệm Pro-GRP.
2. Sử dụng diện tích dưới đường cong ROC là (AUC) để đánh giá so sánh giá trị chẩn đoán bệnh UTP – TBN của xét nghiệm Pro-GRP so với các xét nghiệm NSE, CYFRA 21 – 1, CEA
2.4 Quan điểm về đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu này tiến hành ở đối tượng là bệnh nhân được chẩn đoán và điều trị tại khoa Ung bướu – Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.
Tất cả bệnh nhân đều tự nguyện tham gia nghiên cứu. Được sự đồng ý của bệnh nhân và gia đình bệnh nhân, khơng can thiệp điều trị, khơng u cầu bệnh nhân chi phí, chỉ nhằm bảo vệ và nâng cao sức khoẻ cho bệnh nhân, khơng nhằm mục đích nào khác.
Chỉ đưa vào nghiên cứu những bệnh nhân theo đúng những tiêu chuẩn đã được đặt ra.
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Một số đặc điểm của nhóm bệnh nhân UTP-TBN
3.1.1. Đặc điểm về giới
Bảng 3.1. Tỉ lệ về giới trong UTP-TBN
Tổng số Nam Nữ P n Tỉ lệ (%) n Tỉ lệ (%) 43 32 74,42 11 25,58 < 0,05 Nhận xét:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
theo giới có ý nghĩa thống kê với p < 0,05
3.1.2. Đặc điểm về tuổi
Bảng 3.2. Tỉ lệ bệnh nhân UTP-TBN theo nhóm tuổi
Tuổi Số bệnh nhân (n = 43) Tỷ lệ (%) ≤ 40 1 2,3 41 – 60 12 27,9 61 – 80 26 60,5 ≥ 81 4 9,3 Nhận xét:
Trong nghiên cứu này bệnh nhân ít tuổi nhất là 39 tuổi, cao nhất là 87 tuổi, tuổi trung bình là 64,8 ± 10,9 tuổi. Tỉ lệ mắc UTP-TBN chủ yếu gặp ở độ tuổi > 61. Nhóm bệnh nhân từ 61 – 80 tuổi chiếm tỉ lệ cao nhất (60,5%)
3.1.3. Đặc điểm tiền sử hút thuốc
Bảng 3.3. Tỷ lệ về thói quen hút thuốc
Thói quen Số bệnh nhân (n = 43) Tỷ lệ ( % ) Hút thuốc 32 74,4% Không hút thuốc 11 25,6% Nhận xét:
3.1.4. Các triệu chứng lâm sàng lúc vào viện
Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ (%) các triệu chứng lâm sàng lúc vào viện
Nhận xét:
Các triệu chứng lâm sàng lúc vào viện hay gặp nhất là mệt mỏi (91%), đau ngực bên có khối u (74,28%), ho khan (54,28%), khó thở (54,28), ho ra máu gặp (28,57%) và đa số ho ra máu số lượng ít có dính đờm.
3.2. Nồng độ Pro-GRP huyết tương ở các nhóm nghiên cứu
3.2.1. Nồng độ Pro-GRP ở nhóm bệnh phổi lành tính
Bảng 3.4. Nồng độ Pro-GRP theo giới ở nhóm bệnh phổi lành tính
Nhóm bệnh phổi lành
tính n
Pro-GRP (pg/mL) Trung vị Min Max
Nam (1) 31 30,60 12,39 84,50 Nữ (2) 10 23,65 10,50 41,40 Tổng số (3) 41 28,90 10,50 84,50 p p(1-2) > 0,05 p(3) – 50pg/mL > 0,05 Nhận xét: 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Ho khan Ho máu Khó thở Đau ngực Sốt Mệt mỏi 54,28 28,57 54,28 74,28 20,0 91,0 Tỷ lệ %
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
Nồng độ Pro-GRP giữa 2 giới: nam (30,60 pg/mL) và nữ (23,65 pg/mL) ở nhóm bệnh phổi lành tính là tương đương nhau (p > 0,05). Sự khác biệt về nồng độ Pro-GRP ở nhóm bệnh phổi lành tính trong nghiên cứu này so với các nghiên cứu của nước ngồi (< 50 pg/mL) khơng có ý nghĩa (p > 0,05).
Bảng 3.5. Nồng độ Pro-GRP ở nhóm bệnh phổi lành tính theo nhóm tuổi
Nhóm bệnh phổi
lành tính n
Pro-GRP (pg/mL) Trung vị Min Max
≤ 40 tuổi (1) 10 31,10 17,30 46,65 41 – 60 tuổi (2) 23 24,10 12,00 85,20 61 – 80 tuổi (3) 5 30,60 22,5 41,40 ≥ 81 tuổi (4) 3 15,00 10,50 24,50 p p(1)-(2) > 0,05 p(1)-(3) > 0,05 p(2)-(3) > 0,05 p(1)-(4) < 0,05 Nhận xét:
Nồng độ Pro-GRP giữa các nhóm tuổi ≤ 40 tuổi, 41 – 60 tuổi và từ 61 – 80 tuổi là tương đương nhau
Sự khác biệt về nồng độ Pro-GRP giữa 2 nhóm tuổi ≤ 40 tuổi và ≥ 81 tuổi có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
3.2.2. Nồng độ Pro-GRP huyết tương ở bệnh nhân UTP-TBKN
Bảng 3.6. Nồng độ Pro-GRP theo giới ở nhóm bệnh UTP-TBKN
Nhóm bệnh
UTP - TBKN n
Pro-GRP (pg/mL) Trung vị Min Max
Nam (1) 30 59,40 19,50 112,60
Nữ (2) 17 59,20 16,20 80,10
Tổng số (3) 47 59,20 16,20 112,60
Nhận xét:
Nồng độ Pro-GRP giữa 2 giới: nam (59,40 pg/mL) và nữ (59,20 pg/mL) ở nhóm bệnh UTP-TBKN là tương đương nhau (p > 0,05). Sự khác biệt về nồng độ Pro-GRP ở nhóm bệnh UTP-TBKN trong nghiên cứu này so với các nghiên cứu của nước ngoài (< 50 ng/mL) khơng có ý nghĩa (p > 0,05).
Bảng 3.7. Nồng độ Pro-GRP ở nhóm bệnh UTP-TBKN theo tuổi
Nhóm bệnh
UTP - TBKN N
Pro-GRP (pg/mL)
Trung vị Min Max
≤ 60 tuổi (1) 16 61,09 16,20 112,60
61 – 80 tuổi (2) 23 58,90 20,30 106,00
≥ 81 tuổi (3) 8 60,58 25,40 72,10
p 47 p(1)-(2) > 0,05 p(1)-(3) > 0,05 p(2)-(3) > 0,05
Nhận xét:
Nồng độ Pro-GRP giữa các nhóm tuổi ≤ 60 tuổi, 61 – 80 tuổi và ≥ 81 tuổi khơng có ý nghĩa thống kê (p >0,05)
3.2.3. Nồng độ Pro-GRP huyết tương ở bệnh nhân UTP-TBN
Bảng 3.8. Nồng độ Pro-GRP ở bệnh nhân UTP-TBN theo nhóm tuổi
Nhóm
UTP – TBN n
Pro-GRP (pg/mL)
Trung vị Min Max
≤ 60 tuổi (1) 13 203,20 52,18 2510,00
61 – 80 tuổi (2) 26 174,10 49,20 2772,90
≥ 81 tuổi (3) 4 189,65 111,1 609,00
p p(1)-(3) > 0,05 p(1)-(2) > 0,05 p(2)-(3) > 0,05
Nhận xét:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn
là 189,65 pg/mL khơng có ý nghĩa ( p > 0,05).
Bảng 3.9. Nồng độ Pro-GRP với thói quen hút thuốc
Nhóm UTP-TBN n Pro-GRP (pg/mL)
Trung vị Min Max
Có hút thuốc (1) 32 186,71 52,18 2972,90 Không hút thuốc (2) 11 109,00 49,20 1059,00
p 43 p(1)-(2) > 0,05
Nhận xét:
Tỷ lệ bệnh nhân có hút thuốc ở nhóm UTP-TBN khá cao (32/43). Nồng độ Pro-GRP của nhóm bệnh nhân UTP-TBN có hút thuốc là 186,71 pg/mL và khơng hút thuốc là 109,00 pg/mL. Sự khác biệt về nồng độ Pro-GRP giữa bệnh nhân UTP-TBN có hút thuốc và khơng hút thuốc khơng có ý nghĩa (p>0,05).