Quá trình thủy phân sẽ được tiếp tục phân giải dưới tác động của vi sinh vật lên men axít để tạo thành các axít dễ bay hơi như axít acetic, propionic, formic, lactic, butyric, succinic. Ngồi ra cịn cĩ một số dạng khác như rượu và các xeton (như etanol, metanol, glycerol, aceton), NH3, CO2, và H2.
Do nhiều axít hữu cơ được sinh ra trong quá trình lên men này, nên quá trình vi sinh vật học tổng thể trong giai đoạn này thường được gọi là bước sinh axít.
Các vi khuẩn tạo axit chủ yếu là vi khuẩn tùy tiện phân hủy protít và vi khuẩn amon hĩa axít amin, thường gặp là: Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio, Corynebacterium, Actinomyces, Staphylococcus, Escherichia coli.
Một số loại vi khuẩn hiếu khí cũng tham gia trong giai đoạn đầu của quá trình lên men yếm khí, những vi khuẩn này bao gồm: Psedomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Micrococcus, Sarcina vulgaris, Escherichia Coli.
Trong bể metan cịn gặp vi khuẩn khử sulfat, đĩ là Desulfovibro.
Nhiều loại nấm mốc như Penicillium, Fusarium,…và các động vật nguyên sinh cũng tham gia q trình lên men axít.
Ở cuối giai đoạn này do tạo thành axit và làm cho pH của mơi trường giảm
xuống và làm chậm quá trình trao đổi của vi khuẩn. * Quá trình axêtát hĩa (Acetogenesis):
Các axít là sản phẩm của quá trình trên lại tiếp tục được thủy phân để tạo lượng axít acetic nhiều hơn. Sản phẩm của quá trình này phụ thuộc vào áp suất riêng phần H2
trong mơi trường. Áp suất riêng phần của H2 được giữ < 10-3 atm để vi sinh vật cĩ thể biến đổi H2 thành CH4 theo phản ứng sau:
4H2 + CO2 → CH4 + 2H2O
Các lồi vi sinh vật đầu tiên (dinh dưỡng hydro): là các vi khuẩn cổ hĩa dưỡng
vơ cơ. Chúng dùng H2 để khử CO2 nhằm thu năng lượng và là các vi khuẩn cổ tự dưỡng vì chúng sử dụng CO2 làm nguồn cacbon.
Các lồi vi sinh vật thứ hai (sinh axetat): là các vi khuẩn cổ hố dưỡng hữu cơ vì
chúng cắt axetat thành metan và CO2, thu nhận năng lượng của mình từ axetat: CH3COOH → CH4 + CO2
Axetat là một anion. Khi bị cắt thành metan và CO2, cần cĩ một cation cặp đơi tham gia vào quá trình. Khi ion cặp đơi đĩ là ion NH4+, được sinh ra trong bước lên men đầu, thì amoni bicacbonat NH4HCO3, sẽ được tạo thành. Khi cation cặp đơi là H3O+ được sinh ra trong bước lên men đầu, thì axít cacbonic, H2CO3, sẽ được tạo thành và CO2 sẽ được giải phĩng trong thể tích khí sinh học thốt ra. Kết quả của cả hai trường hợp làm mơi trường trở nên kiềm hĩa (pH lại tăng lên), tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển.
Do vậy sự tạo thành metan xuất hiện như một bước kiềm hĩa.
Nhĩm vi khuẩn chủ yếu trong giai đoạn này là: Methalnobacterium, Methalnosacrina, Methalnococcus, Methalnobrevibacter, Methalnothrix. Về hình thái những vi khuẩn này cĩ hình dạng cầu khuẩn, xoắn khuẩn hoặc trực khuẩn và về sinh lý những vi khuẩn này rất giống nhau đều khơng thể sinh trưởng khi nồng độ oxy vượt quá 0,1%.