(nguồn: Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Thành phần môi trƣờng Tris – Glucose Glycine Tris – BES EDTA Glycine (g) 0,93 EDTA (g) 0,37 Tris (g) 3,025 0,43 Glucose (g) 1,25 1,25 0,59 6 Bicarbonate Na (g) 0,12 Citrate Na.1H2O (g) 1,7 1,45 Nƣớc cất 2 lần (ml) 100 100 100 100 BES (g) 1,49 Lactose (g) 3,4 Penicillin (mg) 100 100 100 100 Streptomycin (mg) 100 100 100 100 Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20 pH 6,82 6,8 6,81 6,81 Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 - 310 464
2.11.Hoạt hóa tinh trùng
Hoạt hóa tinh trùng (sperm capacitation): là q trình biến đổi đầu tiên của tinh trùng trong quá trình vận chuyển từ tử cung đến ống dẫn trứng. Q trình này làm cho tinh trùng có khả năng phóng thích enzyme hyaluronidase, một enzyme làm phân hủy sự liên kết của các tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng, để tinh trùng có thể tiếp cận và kết hợp với màng trong suốt của trứng (zona pellucida). Vì vậy trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) tinh trùng phải đƣợc hoạt hóa (capacitation) trƣớc khi cho kết hợp với trứng đã chín (matured oocyte) (trích dẫn từ Nguyễn Văn Thuận, 2005).
Theo Farstad (2000), môi trƣờng Tyrode cải tiến (Sperm - TALP) thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình hoạt hóa in vitro của tinh trùng bị, chó và cáo.
Các u cầu của q trình hoạt hóa tinh trùng trong ống nghiệm (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003): do tinh thanh ngăn cản phản ứng hoạt hố và có chứa một số chất ức chế hoạt động của tinh trùng nên cần đƣợc loại bỏ. Trong mơi trƣờng hoạt hóa, cần có sự hiện diện các thụ quan của cholesterol, có thể là huyết thanh hoặc albumin huyết thanh bò hoặc ngƣời (BSA hoặc HSA), sẽ thực hiện chức năng làm mất ổn định màng tinh trùng. Huyết thanh có hiệu quả hơn vì có các lipoprotein có khả năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumin. Dịch nang trứng cũng là một thụ quan có hiệu quả cho việc thu nhận cholesterol.
Sirivaidyapong và ctv (1999) cho rằng nồng độ Ca2+ cao trong môi trƣờng Sperm- TALP-1 sẽ làm tăng tỷ lệ tinh trùng chó có phản ứng acrosome (AR) cịn sống và di chuyển trong suốt q trình hoạt hóa ở 37OC. Bởi vì nồng độ Ca2+ trong mơi trƣờng cao sẽ xâm nhập nhanh chóng vào bên trong tế bào (tinh trùng) làm nồng độ Ca2+ bên trong tế bào tăng đến mức có thể hoạt hóa phản ứng acrosome. Ơng chứng minh bằng cách thêm EDTA vào mơi trƣờng thì phản ứng acrosome của tinh trùng chó khơng xảy ra. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ có thể ức chế phản ứng acrosome của tinh trùng.
Phản ứng hoạt hoá tinh trùng có tính chất thuận nghịch. Các tinh trùng hoạt hố có thể trở nên bất hoạt khi cho tinh dịch vào. Hai phƣơng pháp thông dụng nhất dùng trong thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) để hoạt hoá tinh trùng là phƣơng pháp “bơi lên” (swim-up) và phƣơng pháp Percoll. Tỉ lệ thụ tinh của các tinh trùng phân tách từ hai phƣơng pháp này là nhƣ nhau, khi các tinh trùng lấy ra theo 2 phƣơng pháp này đều bình thƣờng nhƣ nhau. Một điều quan trọng khi xử lí mẫu tinh dịch trƣớc khi đƣa vào thụ tinh trong ống nghiệm là tinh dịch cần phải đƣợc rửa sạch hoàn toàn để cho các yếu tố ức chế tinh trùng khơng thể hoạt động đƣợc (trích dẫn từ Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001).
Phƣơng pháp “bơi lên” là phƣơng pháp phổ biến để tách tinh trùng ra khỏi tinh dịch, đƣợc sử dụng từ những năm 1970 đến nay. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa vào sự di động của tinh trùng trong môi trƣờng. Phƣơng pháp này thích hợp cho mẫu tinh trùng có mật độ cao và di động tốt nhƣng không phù hợp cho mẫu tinh có khả năng di chuyển kém (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Farstad và ctv (1993) đã thành công trong việc tạo phơi in vitro trên lồi cáo xanh (Alopex
lagopus), trong q trình hoạt hóa tinh trùng, Farstad đã sử dụng phƣơng pháp “bơi
Năm 2001, Younglai và ctv đã so sánh tác động làm hƣ hại DNA tinh trùng ngƣời của phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng và phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp. Phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc rửa bằng cách ly tâm. Phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc đƣa trực tiếp vào quá trình “bơi lên” hay khơng trải qua bƣớc ly tâm để rửa. Tỉ lệ tinh trùng có DNA bị hƣ hại sau khi hoạt hố bằng 2 phƣơng pháp “bơi lên” này đƣợc so sánh với mẫu tinh dịch ban đầu. Kết quả: sự hƣ hại DNA đều bé hơn 5% trong hầu hết các mẫu và khơng có sự thay đổi ý nghĩa nào trong mẫu DNA đƣợc quan sát giữa 2 phƣơng pháp “bơi lên” này.
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.Nội dung nghiên cứu
- Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng:
+ Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt và phƣơng pháp cạo.
+ So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng, bao gồm phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamell) và phƣơng pháp khơng sử dụng lá kính.
+ Nhuộm xác định tỉ lệ tế bào sống và chết sau khi nuôi cấy.
- Xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa đến chất lƣợng tinh trùng:
+ Bảo quản các mẫu tinh dịch trong mơi trƣờng Tris-glucose. + Hoạt hóa tinh trùng bằng phƣơng pháp bơi lên.
+ Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trƣớc và sau hoạt hóa ở các thời điểm bảo quản.
3.2.Thời gian và địa điểm thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 06-02-2006 đến ngày 06-07-2006 tại trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.3.Vật liệu
3.3.1.Nguồn mẫu
Ống dẫn trứng chó đƣợc thu thập tại lị mổ anh Phƣớc, quận Thủ Đức, Tp. Hồ Chí Minh.
Mẫu tinh chó đƣợc thu tại nhà bác Sáu và nhà chị Hạnh. 3.3.2.Dụng cụ và thiết bị Eppendorf Ống nhựa (falcon) 15 ml Dao Kéo Găng tay Khay Lọ cồn Đầu lọc 0,2 µm
Dây đồng mảnh Kẹp
Ống tiêm 1 ml và kim 26 G Đĩa nuôi cấy 35mm
Nhiệt kế
Bình cách nhiệt Pipette Pasteur Micropipette
Buồng đếm hồng cầu Que thuỷ tinh
Phiến kính, lá kính
Các loại ống đơng có chia độ Kính hiển vi Máy li tâm Cân (độ chính xác 0,001) pH kế (độ chính xác 0,01) Tủ sấy dụng cụ Nồi hấp Tủ cấy Tủ ấm CO2
Tủ bảo ôn ở nhiệt độ 0-10 0C Kính hiển vi soi ngƣợc 3.3.3.Hố chất NaCl NaOH HCl Nigrosin-eosin Dầu xem kính
Thuốc nhuộm Kovács (1992) Mơi trƣờng Tris-glucose
Mơi trƣờng Sperm-TALP-1 theo Sirivaiddyapong và ctv (1999) Môi trƣờng TCM 199
Mơi trƣờng PBS Mơi trƣờng Hepes – 199 Dầu khống Huyết thanh Lịng đỏ trứng Penicillin Streptomycin Gentamycin Kanamycin 3.4.Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1.Ni cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng
3.4.1.1.Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ (Xu và ctv, 1992)
- Chọn những chó cái đang giai đoạn lên giống. Hiên tƣợng lên giống đƣợc chuẩn đoán lâm sàng với những đặc điểm nhƣ: âm hộ sƣng lên và có dịch tiết; khơng có sự xuất hiện của thể vàng trên bề mặt buồng trứng.
- Gây chết nhƣng không trụng nƣớc sơi và thui nóng chó. - Dùng dao mổ từ rốn trở xuống 5 cm.
- Dùng 2 ngón tay kéo thận ra.
- Dùng kéo cắt màng treo của bao buồng trứng gắn vào thận và cắt sừng tử cung. - Thu nhận phức hợp gồm bao buồng trứng và 1 phần sừng tử cung.
- Trữ 250 C trong môi trƣờng PBS đƣợc bổ sung FCS 2%, penicilin 100 IU/ml và streptomycin 100 µg/ml.
- Vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm.
3.4.1.2.Xử lý ống dẫn trứng tại phịng thí nghiệm (Xu và ctv, 1992)
- Dùng kéo tách ống dẫn trứng từ phức hợp gồm bao buồng trứng và một phần sừng tử cung.
- Tách mô liên kết, tua viền của ống dẫn trứng.
- Rửa ống dẫn trứng trong môi trƣờng Hepes-199 đƣợc bổ sung ECS 10%, penicilin 100 IU/ml và streptomycin 100 µg/ml.
Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199 Dùng dây đồng mảnh luồn vào trong ống dẫn trứng
Lộn ngƣợc bề mặt trong của ống dẫn trứng Dùng 2 kẹp vuốt để tách những mảnh biểu mô
Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm chứa 3 ml môi trƣờng Hepes - 199
Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn
Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút)
Giữ cặn Loại bỏ dịch nổi
Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes – 199, trộn đều
Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút)
Thu nhận tế bào biểu mô ở dạng mảnh nhỏ Loại bỏ dịch nổi
3.4.1.3.Thu thập tế bào biểu mơ ống dẫn trứng
Thí nghiệm 1: so sánh 2 phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng.
Chỉ tiêu quan sát là thời gian thu thập tế bào và khả năng gây nhiễm vi sinh vật của mỗi phƣơng pháp. Sự nhiễm vi sinh vật đƣợc đánh giá thông qua sự đổi màu của môi trƣờng nuôi cấy.
Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199 Cố định ống dẫn trứng lên các đầu ngón tay
Dùng kéo cắt dọc ống dẫn trứng Mở bề mặt trong của ống dẫn trứng
Dùng dao cạo nhẹ nhàng để tách những mảnh biểu mô
Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm chứa 3 ml môi trƣờng Hepes – 199
Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn
Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút)
Giữ cặn Loại bỏ dịch nổi
Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes-199, trộn đều Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút)
Loại bỏ dịch nổi Thu nhận tế bào biểu mô (ở dạng mảnh nhỏ)
3.4.1.4.Nuôi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng
Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Tế
bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy ở dạng mảnh (Xu và ctv, 1992). Do đó những tế bào này khó bám vào đáy đĩa ni cấy để đƣợc cố định. Để giải quyết nhƣợc điểm này, phƣơng pháp sử dụng lá kính cố định những tế bào này đƣợc đặt ra và đƣợc so sánh với phƣơng pháp khơng sử dụng là kính. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” (vesicle – like).
a/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính
- Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mơ ống dẫn trứng cho vào đĩa petri loại 35 mm, đƣợc phủ gelatin 1%.
- Đánh dấu vị trí bơm tế bào vào đĩa.
- Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37oC, ẩm độ cao) trong 5 phút. - Dùng lá kính đƣợc cắt 1/4 đậy lên vị trí vừa đánh dấu.
- Bơm nhẹ nhàng 3 ml môi trƣờng TCM – 199 đƣợc bổ sung ECS 10% lên bề mặt lá kính.
- Ghi kí hiệu trên đĩa.
- Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37oC, ẩm độ cao).
- Quan sát tế bào biểu mơ dƣới kính hiển vi soi ngƣợc mỗi ngày 1 lần. b/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp khơng sử dụng lá kính
- Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mơ ống dẫn trứng cho vào đĩa petri (loại 35 mm, đƣợc phủ gelatin 1%) chứa 3 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10%.
-Ghi kí hiệu trên đĩa.
- Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37oC, ẩm độ cao).
Đĩa tế bào sau một thời gian nuôi cấy
Hút bỏ 2 ml môi trƣờng bề mặt và dùng kẹp gấp lá kính ra
Giữ cặn, thêm 1 ml trypsin, trộn đều
Hút 0,5 ml huyễn dịch tế bào vào 0,5 ml môi trƣờng PBS, trộn đều Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 2 phút)
Loại bỏ dịch nổi Quan sát và lắc nhẹ đĩa đến khi tế bào vừa đƣợc tách (3-4 phút) Trung hoà trypsin bằng 1 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10%
Li tâm 2 lần (240 vịng/phút, 2 phút) (bằng mơi trƣờng PBS) Loại bỏ dịch nổi Giữ cặn và tạo huyền phù
Hòa tan dung dịch trypan blue 2% với tỉ lệ 1:1 (2 phút, nhiệt độ phòng) Cho hỗn hợp này vào buồng đếm hồng cầu
Quan sát, đếm tế bào sống (màu trắng) và tế bào chết (màu xanh) 3.4.1.5.Nhuộm xác định tế bào chết và tế bào sống bằng trypan blue (Nigel
Jenkins, 1999; Nhan Ngọc Hiền, 2005)
Ghi
chú: Quy trình này dùng để nhuộm những tế bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy bằng phƣơng pháp “sử dụng lá kính”.
Cơng thức tính tỉ lệ tế bào ni cấy cịn sống tại thời điểm nhuộm:
3.4.2.Hoạt hóa tinh trùng
Thí nghiệm 3: xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa
tinh trùng đến chất lƣợng tinh trùng. Thí nghiệm gồm 2 yếu tố (thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng). Chỉ tiêu quan sát bao gồm các chỉ tiêu đánh giá tình trạng tinh trùng nhƣ: hoạt lực, nồng độ, độ kỳ hình, tình trạng sống cịn acrosome và cƣờng độ hoạt động của tinh trùng.
3.4.2.1.Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phịng thí nghiệm
(Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005)
- Thu nhận tinh dịch pha 2 vì pha này có nồng độ tinh trùng cao, ít tinh thanh. - Dùng pipette (1000 µl) hút mẫu tinh vào ống falcon (15 ml, đƣợc gói giấy bạc). - Thêm mơi trƣờng tris – glucose vào ống falcon này với tỉ lệ 1:1, trộn đều một cách nhẹ nhàng.
- Chia nhỏ mẫu tinh đã pha loãng vào đầy từng ống eppendorf (1,5 ml), nhằm tránh sóng lắc trong q trình vận chuyển.
- Trữ những eppendorf này vào bình đá (0 – 40C). - vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm.
3.4.2.2.Hoạt hóa tinh trùng
Với mẫu tinh đã đƣợc pha lỗng trong mơi trƣờng tris – glucose, chia 3 nhóm và đƣợc khảo sát ở 3 thời điểm tƣơng ứng là 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ. Mỗi nhóm đƣợc chia làm 2 phần: phần A có thể tích là 0,5 ml và phần B có thể tích là 1 ml. Phần A đƣợc dùng đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng trƣớc khi hoạt hóa. Phần B đƣợc đƣa vào quy trình hoạt hóa tinh trùng và đƣợc đánh giá ngay sau khi hoạt hoá.
Mẫu tinh dịch pha lỗng trong mơi trƣờng Tris – glucose (1 ml) Li tâm 2 lần (240 vịng/phút, 5 phút) (dùng mơi trƣờng Sperm – TALP – 1)
Thu phần đáy loại bỏ dịch nổi
Thêm 1 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1 Trộn đều (nhẹ nhàng)
Bơm nhẹ nhàng 1 ml hỗn hợp này vào đáy của ống falcon chứa 4 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1
Đặt ống falcon vào tủ CO2 (5% CO2, 37oC, ẩm độ cao) theo một gốc xiên 300 so với mặt phẳng ngang.
Sau 1 giờ, dựng thẳng ống falcon (nhẹ nhàng, chậm rải) Giữ yên ống falcon 5 phút
Dùng pipette hút 1 ml dịch nổi ở phần trên cùng vào eppendorf 1,5 ml Tinh trùng đƣợc hoạt hóa theo quy trình sau (Younglai và ctv, 2001; Phan
Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001):
Đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng
Các chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng tinh trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp sau (Thái Thi Mỹ Hạnh, 2005)
a/ Đánh giá hoạt lực (A)
Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khơ, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40.
Nhằm phản ánh hoạt động tối ƣu của tinh trùng, đặt tinh trùng ở 37OC khi kiểm tra hoạt lực. Có 3 loại vận động đƣợc quan sát: vận động tiến thẳng, vận động vòng quanh và vận động lắc lƣ. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng dựa trên tỉ lệ tinh trùng tiến thẳng và cho điểm từ 0 - 1.
b/ Đánh giá nồng độ tinh trùng (C)
Tiến hành:
+ Dùng lá kính đặt lên buồng đếm hồng cầu.
+ Pha loãng tinh bằng ống pha loãng hồng cầu, trong dung dịch NaCl 3%, với độ pha loãng 200 lần.
+ Lắc nhẹ ống pha loãng theo vòng số 8 khoảng 4 – 5 lần.
+ Loại bỏ 4 – 5 giọt tinh pha loãng ở đầu ống mao dẫn của ống pha loãng.
+ Nhỏ 0,5 – 1 giọt tinh pha loãng vào buồng đếm hồng cầu.
+ Đếm đầu tinh trùng ở vật kính 40 trong 80 ơ nhỏ, đƣợc đại diện bởi 5 ô lớn (4 ơ ở 4 góc và 1 ơ ở chính giữa).
Số lƣợng tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha lỗng với mơi trƣờng Tris – glucose đƣợc tính theo cơng thức:
C = n * b * 50.000 Trong đó:
C : Nồng độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha lỗng với mơi trƣờng tris – glucose