CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Phân tích định lượng saponin trong củ sâm Việt Nam
Để đánh giá chất lượng sâm thì chỉ tiêu quan trọng nhất là thành phần và hàm lượng saponin trong mẫu sâm. Kết quả nghiên cứu trên một số mẫu sâm Ngọc Linh thu thập được theo các năm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy các mẫu sâm Ngọc Linh khảo sát đều có các vết có giá trị Rf và màu sắc tương ứng với vết của các chuẩn MR2, G-Rg1, G-Rb1. Đồng thời sử dụng phương pháp đo quang theo chuẩn MR2 để xác định hàm lượng saponin toàn phần trong các mẫu sâm, kết quả được cho thấy sâm càng nhiều năm tuổi tăng từ 4 năm đến 10 năm hàm lượng saponin tăng mạnh, tuy nhiên khi đến 15 năm tuổi hàm lượng sâm tăng khơng đáng kể (Viện Thổ nhưỡng, Nơng Hóa, 2013).
Để xác định rõ hàm lượng của các thành phần MR2, G-Rb1 và G-Rg1 trong saponin của sâm Ngọc Linh, các kết quả nghiên cứu thường sử dụng phương pháp HPLC (sắc khí lỏng hiệu năng cao). Hàm lượng MR2 được tính dựa trên diện tích pic đo ở bước sóng 190 nm và hàm lượng G-Rg1 và G-Rb1 được tính dựa trên diện tích các pic đo ở bước sóng 203 nm.
Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần theo phương pháp bên dưới:
- Định lượng saponin bằng phương pháp sắc ký lỏng theo dược điển Việt Nam V, 2018:
Dung dịch chuẩn: Hòa tan các chất chuẩn ginsenosid-Rb¹, ginsenosid-Rd,
ginsenosid-Rg¹ và mạjonosid-R² trong methanol 70 % (TT) để được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ mơi chuẩn lần lượt chính xác khoảng 0,1 mg/ml; 0,1 mg/ml; 0,3 mg/ml; 0,5 mg/ml.
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,1 g bột dược liệu (qua rây số 355) vào
ống nghiệm có nắp, thêm chính xác 10 ml methanol 70 % (TT), đậy nắp, cân.
Chiết bằng siêu âm trong 40 phút ở 30 °C, mỗi 10 phút lắc đều ống, để nguội, cân lại, bù khối lượng đã mất bằng methanol 70 % (TT) để được khối lượng ban đầu, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm.
Điều kiện sắc ký: Cột kích thước (15 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ờ bước sóng 196 nm. Tốc độ dịng: 1 ml/min. Thể tích tiêm: 20 μl.
Cách tiến hành: Tiến hành sắc ký theo chương trình dung mơi như sau: Tiêm lần
lượt dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Thứ tự rửa giải: ginsenosíd-Rg¹; majonosid-R² ginsenosid-Rb¹, ginsenosid-Rd. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, tính số đĩa lý thuyết của cột.
Số đĩa lý thuyết của cột khơng được nhỏ hơn 40000 tính theo pic của majonosid- R². Độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic ginsenosid-Rg¹, majonosid-R²; ginsenosid-Rb¹, ginsenosid- Rd trong 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %. Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, dung dịch thử.
Tính hàm lượng ginsenosid-Rg¹; majonosid-R²; ginsenosid-Rb¹, ginsenosid-Rd trong dược liệu dựa vào diện tích pic ginsenosid- Rg¹; majonosid-R²; ginscnosid-Rb¹, ginsenosid-Rd trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng của các chất chuẩn.