Các ch ng S.aureus đ c nuôi c y và phân l p t các m u b nh ph m máu, m thu
đ c t các b nh nhi.
III. Th i gian và đa đi m nghiên c u
Th i gian: t tháng 11-2013 đ n tháng 04-2014. a đi m: b nh vi n Nhi đ ng II, Tp H Chí Minh.
IV. B nh ph m, môi tr ng phân l p xác đnh vi khu n và sinh ph m
IV.1 B nh ph m
- Máu và m c a b nh nhi t i b nh vi n nhi đ ng II t tháng 11-2013 đ n tháng 1-2014 IV.2 Môi tr ng
- Nuôi c y phân l p: BCP, BA, CA.
- Môi tr ng xác đnh đ nh y c m c a vi khu n v i kháng sinh: MHA. - Môi tr ng đ nh danh: Chapman, Huy t t ng th đông khô, Urease, ODC. IV.3 Sinh ph m + B nhu m gram: - Crystal violet. - Lugol. - Alcohol – acetol. - Safranin.
+ Hóa ch t: dùng đ pha môi tr ng, n c c t, n c mu i sinh lý. + Thu c th .
+ a kháng sinh.
- S d ng đ a kháng sinh c a hãng Biorad.
- Các đa kháng sinh đ t cho S.aureus g m: Penicilline, Oxacilline, Gentamycine, Ciprofloxacin, Erythromycin, Clindamycin, Vancomycin, Trime-sulfame, Chloram, Rifampin.
STT Tên kháng sinh Ký hi u N ng đ đa kháng sinh Gi i h n (mm) 1 Penicilline P 10 µg ≥28 ≤29 2 Oxacilline Ox 30µg ≥21 ≤22 3 Gentamycine CN 10µg ≥12 ≤15 4 Erythromycin E 15µg ≥13 ≤23 5 Rifampicin RD 5µg ≥16 ≤20 6 Ciprofloxacin CIP 5µg ≥15 ≤21 7 Vancomycin VA 30µg - - 8 Clindamycin CD 2µg ≥14 ≤21 9 Chloramphenicol C 30µg ≥12 ≤18 10 Trimethoprime- Sulfamethoxazone (Bactrime) SXT 25µg ≥10 ≤16
B ng 4: Các đa kháng sinh đ t cho S.aureus
IV.4 Thi t b
- T an toàn sinh h c. - T m 35 – 370C.
- T CO2 5% CO2, 35-370C. - T l nh.
- Máy l c ng nghi m (Vortex). - Kính hi n vi.
IV.5 Trang b khác - D u soi kính hi n vi. - Gi y lau v t kính hi n vi. - Khuyên c y/ pipet Pasteur. - Giá ng nghi m.
- G ng tay, kh u trang, nón, áo chồng, dung d ch kh khu n.
V. Phân l p và xác đnh V.1 Ph ng pháp nghiên c u
- Xác đnh m c đ kháng kháng sinh c a S.aures phân l p đ c b ng ph ng pháp Kirby-Bauer theo h ng d n c a CLSI- 2012 (Hoa k ).
- Môi tr ng, sinh ph m và đa kháng sinh c a hãng Bio-Rad. - Thu th p và nh p d li u vào s và Excel.
- X lý k t qu b ng Excel.
V.2 K thu t nghiên c u
V.2.1B nh ph m:
V.2.1.1 M u máu
V.2.1.1.1 Th i đi m l y m u:
Tr c khi b nh nhân dùng kháng sinh và t t nh t là khi b nh nhân b n l nh ho c đang l nh run tr c ho c khi đang lên c n s t.
V.2.1.1.2 Ph ng pháp:
Chu n b :
-Chai c y máu đ nhi t đ phòng kho ng 15 phút tr c khi b m máu. Sát trùng và ch n nút chai b ng gòn t m c n 70% .
-L y kim tiêm ra kh i bao, ki m tra kim có thơng khơng.
L y m u:
- Ch n t nh m ch, bu c dây garo phía trên cách ch l y máu kho ng 5cm.
- Sát khu n vùng da đã ch n t nh m ch: Dùng k p l y gòn nhúng vào dung d ch sát khu n nh : Povidine 3.5% ho c Chlohexidine, lau t trong ra ngồi, đ n khi khơ. Lau
s ch b ng bơng gịn th m c n 70%. Sát khu n nh trên 1 l n n a đ n khi khô ( tránh nhi m khu n tr l i không l y tay ch m vào vùng t nh m ch).
- Tiêm kim vào t nh m ch, kéo nh , rút đ l ng máu c n thi t (tr s sinh:1-2ml, tr l n:2-5ml), tránh t o b t khí.
- Tháo dây garo, rút kim, ép nh bông th m c n vào ch tiêm.
- B gòn trên chai c y máu ch khô, b m máu v a l y vào chai (nh nhàng tránh tán huy t). Kh trùng n p chai c y máu l n n a sau khi rút kim.
V.2.1.1.3 V t li u l y và chuyên ch
V t li u l y m u: Chai c y máu BACTEC. Chuyên ch :
- Chai c y máu: B o qu n t 2-250C.
- Chai c y máu sau khi b m chuy n đ n khoa Vi sinh càng s m càng t t và ph i đ c x lý trong vòng 2h sau khi l y m u. N u vì lý do nào đó khơng th kh o sát ngay thì có th gi m u b nh ph m trong t l nh nhi t đ 2-30C nh ng không quá 2 gi t khi l y m u. B o qu n nhi t đ th ng khi v n chuy n.
V.2.1.2 M u m
V.2.1.2.1 Th i đi m l y m u
- Càng giai đo n s m c a b nh càng t t. Ngh a là ti n hành l y m u ngay sau khi có ch n
đốn lâm sàng.
V.2.1.2.2 Ph ng pháp:
Chu n b : T m bông vô trùng L y m u:
D a vào m ng i ta chia làm 2 lo i:
1. m đã v (bao g m v t th ng h có m ): - Lau s ch vùng da xung quanh v i c n 70%
- Lau s ch m trên v t th ng b ng g c vô trùng th m n c mu i sinh lý - Dùng t m bông đã th m n c mu i sinh lý đ l y b nh ph m
*N u v t th ng b nhi m trùng, c t l c vùng mô d i l p m đã lau s ch, n n n m , dùng t m bông vô trùng đ th m sau đó cho vào l vơ trùng
2. m kín:
- Sau khi sát trùng vùng da bên ngoài, đ khô, ch c kim hút l y m ho c d ch b m vào l vô trùng
- L y đ c nhi u m : b m vào l vô trùng
- L y đ c ít m : hút thêm Nacl sau đó cho vào l vô trùng
V i m m i, khi hút thì b m NaCl vào, sau đó hút l i, cho vào l vơ trùng V.2.1.2.3 V t li u l y và chuyên ch
V t li u l y m u: T m bông vô trùng Chuyên ch :
- Chai c y máu: b o qu n t 2-250C
- M u m sau khi l y chuy n đ n khoa Vi sinh càng s m càng t t và ph i đ c x lý trong vòng 2h sau khi l y m u. B o qu n nhi t đ th ng khi v n chuy n.([22])
V.3 Qui trình ni c y phân l p và xác đnh S.aureus: V.3.1 Nguyên t c: V.3.1 Nguyên t c:
- Phân l p hay tách r i vi khu n t m t h n h p d a trên nguyên t c làm c n d n m m c y.
- Các vi khu n s m c tùy theo t ng lo i môi tr ng và nhi t đ .
-D a vào khu n l c đ c tr ng t đó đ nh danh vi sinh v t b ng các ph n ng sinh hóa chuyên bi t, ng ng k t.
- Làm kháng sinh đ b ng ph ng pháp đa gi y khuy ch tán kháng sinh trong th ch MHA.([23])
V.3.2 Nh n và đ ng kí m u
B nh ph m là: máu và m đ c g i t các khoa lâm sàng đ n khoa vi sinh t i b nh vi n nhi ng II t tháng 11/2012 đ n tháng 1/2013.
Thông tin v đ tu i, gi i tính đ c ghi vào phi u xét nghi m.
Có s liên h ch t ch gi a khoa đi u tr và phòng vi sinh đ ghi nh n thơng tin đ y đ và chính xác. ([22])
V.3.3 Quy trình ni c y, phân l p:
V.3.3.1 C y máu:
V.3.3.1.1 Kh o sát vi th
1. t chai c y máu vào trong máy c y máu
2. Khi máy c y máu báo d ng: l y chai d ng ra kh i máy, ki m tra mã code trên chai và phi u xét nghi m xem có s trùng kh p hay khơng
3. L y chai c y máu d ng ti n hành nhu m Gram, soi t i và c y:
Sát khu n chai c y máu b ng c n 70% đ khô, b t đèn gas ho c đèn c n, h l a đ u chai và l c đ u.
Dùng kim tiêm vô trùng đâm vào đ u chai và l y m t l ng máu đ đ : soi t i, nhu m Gram và c y vào 3 môi tr ng BA, CA, BCP (c y ria)
* C y:
- Theo dõi quá trình c y: ki m tra các h p th ch sau khi trong t m, t CO2 kho ng 18-24h, tìm các khu n l c nghi ng , nhu m Gram, xem hình th , th các tính ch t sinh hóa xác đnh loài và làm kháng sinh đ
- các đ a môi tr ng:
CA, BA đã c y trong t CO2 35- 370
C v i 5% CO2 trong 18-24 gi .
BCP đã c y trong t th ng trong 18-24 gi .
ng SAD (1 ng nhi t đ phòng/18-24 gi , 1 ng 370C/18-24 gi ) * Soi t i và nhu m Gram:
- Chu n b 2 lame kính vơ trùng
+ Lame 1: nh m t gi t máu đ soi t i (soi t i đ quan sát s di đ ng và hình d ng vi khu n)
+ Lame 2: nh m t gi t máu và tr i đ u thành m t ph t 2-3 cm/lame. khơ t nhiên sau đó h nh qua ng n l a đèn c n đ c đnh m u.
- Nhu m Gram:
* N u nhu m Gram th y:
- N m: chuy n vào 2 ng SAD (c y ria trên th ch nghiêng)
- Tr c khu n gram âm nh ng n (nghi ng Gaemophilus) v ch 1 đ ng t c u lên h p th ch BA sau khi c y b nh ph m
- C u khu n Gram d ng đôi chu i: đ t thêm đa kháng sinh Optochin và Bacitracin lên h p BA. Theo dõi và làm kháng sinh đ n u th y vi khu n m c (k t qu nhu m soi th y thu n 1 lo i vi khu n)
V.3.3.2 C y m :
V.3.3.2.1 Kh o sát đ i th : màu s c, đ đ c, mùi Màu s c: đ , vàng, xanh lá, nâu đ , h ng…
D ch hút abces gan (th ng do amip): đ c, nâu s m ho c vàng nh t
M t v t th ng sau ph u thu t ho c ch n th ng, b ng: xanh lá (th ng do
P.aeruginosa)
Mùi: th i, tanh, h ng…
Hơi: do vi khu n k khí ho c h n h p hi u, k khí
M u b nh ph m có mùi v i k t qu nhu m Gram: báo cho lâm sàng đ đ nh h ng s
S đ 1: QUY TRÌNH C Y MÁU BACTEC (+) Nhu m Gram: -B t màu gram -Hình d ng, cách s p x p -BCP ( t th ng) - 2 ng SABOURAUD (1 nhi t đ phòng, 1 t m) -BA, CA ( t CO2)
Báo cáo ngay cho lâm sàng: -Hình d ng: Cocci ho c Baci -Gram (+) ho c Gram (-)
nh danh KS
- nh danh: Làm tr c nghi m sinh hóa, api, ng ng k t Theo k t qu nhu m Gram và đ c khóm trùng sau khi c y
C y
Khóm trùng
Tính ch t: l ng, đ c, nh y, có l n máu…
Mù ng t c : có h t l u hu nh màu vàng, b nh vùng m t c do Actinomyces Chi d i, m abces: ch a h t nh nhi u màu ( đen, đ …) là do u n m ho c u h t M abces l nh do lao: gi ng phomat ho c bã đ u
V.3.3.2.2 Kh o sát vi th :
- S d ng que ph t l y m (c y tr c làm lam nhu m sau) l n nh nhàng trên 3 môi tr ng CA, BA, BCP và lam đã kh trùng, không c xát ho c quá áp sát
- Nhu m gram.([22]) M Nhu m Gram Báo cáo K t qu s b cho lâm sàng Ch K t qu c y Khơng có vi khu n ho c đa nhi m C y: -BA, CA ( t CO2) -BCP ( t th ng) -SABOURAUD nh danh: Tr c nghi m sinh hóa, ng ng k t, api, huy t thanh, kháng sinh đ S đ 2: QUY TRÌNH C Y M c khóm trùng N u có vi khu n thu n khi t
Nhu m Gram
Nguyên t c
Do s khác bi t v c u trúc t bào, vi khu n Gram d ng s gi đ c ph c h p màu tím Getian-iode và không b t y màu b i alcool trong khi vi khu n Gram âm không gi đ c ph c h p này.
Cách ti n hành [14]
A.T o phi n ph t
Ghi tên m u ho c s nh n di n trên lam (lam ph i s ch và khơ).
Dùng vịng c y l y m t vòng c y đàm (ch n vùng nh y m ), n u l ng l y 2-3 khuyên tr i đ u trên mi ng lam 1x2 cm, đ khô t nhiên.
C đnh b ng cách dùng c n tuy t đ i ho c đ a nh nhàng lam kính c t ngang ng n l a
đèn c n 2-3 giây tránh làm quá nóng.
B.K thu t nhu m
t lam đã ph t m u lên giá đ ng.
Nh vài gi t Crystal violet cho ph đ u lên b m t ph t nhu m và đ yên trong 1 phút. b dung d ch Crystal violet và r a s ch lam kính t t , nh nhàng b ng n c máy. Lugol cho ph trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1 phút.
R a l i lam b ng n c máy t t và nh nhàng.
T y màu b ng cách c m m t đ u lam và nh t t Alcohol 95% ho c Alcohol– Acetol lên ph t nhu m cho đ n khi vùng phi n kính b c màu đi (thông th ng là t 10 đ n 15 giây).
R a nhanh b ng n c (m s n vòi n c tr c khi b t đ u kh màu).
Nh vài gi t Safrafin cho ph đ u lên trên b m t ph t nhu m và đ yên trong vòng 1phút.
R a nhanh b ng n c nh nhàng và đ khơ t nhiên và quan sát d i kính hi n vi v t kính d u ×100 (v t kính ×10), tìm vùng nh y nh t r i ghi nh n s l ng t bào v y (là các t bào có góc c nh) và các t bào b ch c u hay t bào m (là các t bào tròn nh h n, n đ m màu trên toàn t bào).Vi khu n Gram d ng b t màu tím, Gram âm b t màu h ng. ([2])
C y phân l p
Nguyên t c
Ph ng pháp c y phân l p tách riêng bi t t ng t bào vi sinh v t trên môi tr ng nuôi c y. T m t t bào ban đ u sau m t th i gian nuôi c y s t o ra m t khóm hay khu n l c.
Qui trình
1. V i m u máu: Sau khi sát trùng chai c y máu Batec, s d ng kim tiêm rút l ng máu v a đ đ c y, nhu m gram và soi t i.
V i m u m : - Nh ng m u có que gịn thì dùng que gịn l n đ u trên các h p th ch và lam kính, sau đó ngâm que gịn vào canh thang l u m u.
- Nh ng m u m d ng d ch thì dùng Pipet pasteur hút l ng v a đ đ c y, nhu m Gram và l u m u trong canh thang.
2. t khuyên c y và sau khi đ ngu i c y zig zag trên môi tr ng CA, làm t ng t v i các môi tr ng BA, BCP.
3. các đ a môi tr ng:
CA, BA đã c y trong t CO2 35- 370C v i 5% CO2 trong 18-24 gi .
BCP đã c y trong t th ng trong 18-24 gi .
Theo dõi quá trình c y: ki m tra các h p th ch sau khi , tìm các khu n l c nghi ng , nhu m Gram, xem hình th , th các tính ch t sinh hóa xác đnh loài và làm kháng sinh đ .([2])
V.3.4 c đi m khu n l c c a S.aureus trên môi tr ng nuôi c y phân l p và nhu m Gram:
C u khu n Gram d ng đ ng riêng l , t ng đôi, 4 t bào hay d ng chùm nho, trong l a
c y già thành gram âm, không di đ ng, không t o bào t . Trên môi tr ng không ch n l c, khu n l c Staphylococci th ng có đ ng kính 1-3mm sau 24h/350C-370C, nhi t đ phòng (200C-250C) là t t nh t đ ti t s c t . Khu n l c màu tr ng đ c khơng s c t hay có s c t t vàng kem đ n vàng cam. S.aureus là vi khu n d nuôi c y, phát tri n nhi t đ 100C-450C và n ng đ mu i t i 10%. Trên môi tr ng th ch th ng t o khu n l c d ng S (đ ng kính 1- 2mm). Sau 24h/35-370C, khu n l c th ng có màu vàng chanh.Trên canh thang, làm đ c môi tr ng, l ng c n khi đ lâu.([22])
Trên BA, t o khu n l c tròn, nh , màu tr ng đ c, bóng, l i và tan máu Trên BCP, t o khu n l c tròn, nh , màu vàng kem, bóng, l i và làm mơi tr ng đ i màu t tím Trên CA, t o khu n l c