2.3.2. Dụng cụ
Bình cầu 2000 mL Pipet
Bình tỷ trọng 5 mL Nhiệt kế
Bình lắng gạn 50 mL Phễu chiết
Bình định mức 25 mL, 50 mL Đũa thủy tinh
Bình nón 50 mL Giấy lọc
Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 500mL Lọ chứa tinh dầu 2.3.3. Hoá chất Diethyl ether Dung dịch Phenolphtalein Dung dịch KOH 0,1N Na2SO4 khan CuSO4 Etanol Nước cất
2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tinh dầu được trích ly bằng phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước có hỗ trợ siêu âm.
Xác định thành phần hóa học, hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS.
Đo tỷ trọng được xác định bằng phương pháp đo bình tỷ trọng. 2.5 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.5.1. Trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước có hỗ trợ siêu âm siêu âm
2.5.1.1. Thu và xử lý mẫu
Hoa sứ được thu hái tại Quận Bình Thủy, Thành phố Cần Thơ.
Hoa được lấy vào lúc buổi sáng sớm, trời khô ráo và được bảo quản trong túi nhựa màu sẫm và được tách tinh dầu sau 12 giờ kể từ khi lấy mẫu.
Chọn những cụm hoa tươi, khơng dập, nở to, sau đó tách riêng từng hoa và rửa sạch, cắt nhỏ với các kích thước khác nhau.
Hoa sứ được bảo quản tươi cho đến khi tiến hành thí nghiệm chưng cất lơi cuốn hơi nước có hỗ trợ siêu âm để trích ly tinh dầu.
Hình 2.6. Xử lý mẫu hoa sứ 2.5.1.2. Chưng cất và làm tinh khiết 2.5.1.2. Chưng cất và làm tinh khiết
Cân khoảng 500 g hoa sứ cho vào bình cầu 2000 mL, thêm nước cất xấp xấp mặt nguyên liệu.
Đánh siêu âm trong khoảng 30 phút.
Lắp bình cầu vào hệ thống chưng cất hơi nước và tiến hành đun. Khi sôi, hơi nước sẽ lôi cuốn tinh dầu đi lên và ngưng tụ vào ống gạn.
Khảo sát ba yếu tố thời gian, nhiệt độ, kích thước nguyên liệu ảnh hưởng đến thể tích tinh dầu thu được.
Sau quá trình chưng cất tiến hành làm sạch tinh dầu.
Để cho việc tách tinh dầu ra dễ dàng, phân lớp rõ ràng của lớp nước và tinh dầu. Cho thêm diethyl ether vào hỗn hợp nước và tinh dầu để cho tinh dầu tan vào diethyl ether làm giảm tỷ trọng tinh dầu để thuận lợi tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp.
Sau khi tách tinh dầu ra khỏi hỗn hợp nước chưng tiếp tục cho một ít Na2SO4 khan
để làm khan triệt để những hạt nước còn trong lớp tinh dầu.
Lấy phần nước chưng cịn lẫn ít tinh dầu đem lắc với diethyl ether và làm khan bằng Na2SO4 để thu triệt để tinh dầu.
Tinh dầu tinh khiết mang đi bảo quản trong chai thủy tinh sẵm màu ở nơi mát mẻ để tráng bị ánh sáng phân hủy.
Hình 2.7. Sơ đồ quy trình tách chiết tinh dầu từ hoa sứ 2.5.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu 2.5.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu
Tiến hành khảo sát 3 yếu tố làm ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu: Thời gian trích ly, nhiệt độ và kích thước nguyên liệu trích ly.
Nguyên tắc: Cố định 2 yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được điều kiện tối ưu cho yếu tố đó. Sau đó thực hiện tương tự cho 2 yếu tố cịn lại. Cuối cùng tính thành phần phần trăm hàm lượng tinh dầu thu được.
2.5.2.1. Khảo sát thời gian trích ly
Thời gian trích ly càng dài, hiệu suất thu nhận sản phẩm càng tăng, nhưng đến một ngưỡng thời gian nhất định thì lượng sản phẩm thu được tăng thêm khơng đáng kể, đồng thời có thể ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm.
Nước Nguyên liệu
Xử lý Cắt nhỏ
Nguyên liệu đã sơ chế
Chưng cất
Lắc với diethyl ether
Bình lắng gạn
Nước chưng cất Tinh dầu thơ
Bình lắng gạn
Tinh dầu Nước
Tinh dầu tinh khiết
Làm khan bằng Na2SO4 Đánh siêu âm 30 phút
Cố định 2 yếu tố nhiệt độ và trạng thái nguyên liệu khi trích ly và thay đổi thời gian trích ly ở những giai đoạn 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút. Thời gian được bắt đầu tính từ lúc thu được giọt dầu đầu tiên ngưng tụ nhỏ xuống ống gạn.
Quan sát số mL tinh dầu để so sánh hàm lượng tinh dầu ở mỗi thời gian trích ly khác nhau từ đó chọn được thời gian trích ly tối ưu nhất.
2.5.2.2. Khảo sát nhiệt độ trích ly
Nhiệt độ trích ly là một trong những yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến q trình trích ly. Khi nhiệt độ càng cao nguyên liệu trương nở và tinh dầu sẽ linh động hơn, tạo điều kiện cho q trình trích ly. Trái lại, nhiệt độ tăng cao sẽ thúc đẩy các biến đổi hóa học của các thành phần trong nguyên liệu, ảnh hưởng tới chất lượng tinh dầu.
Với thời gian ly trích tối ưu đã chọn, tiếp tục cố định trạng thái nguyên liệu khi trích ly. Ta khảo sát q trình trích ly tinh dầu với những nhiệt độ khác nhau là: 80 oC, 90 oC, 100 oC.
2.5.2.3. Khảo sát kích thước mẫu nguyên liệu ly trích
Tùy thuộc tính chất (nguyên liệu màng tế bào, chất nguyên sinh, một số tạp chất), trạng thái rắn lỏng, cách thức chuẩn bị mẫu nguyên liệu (kích thước) sẽ ảnh hưởng rất lớn đến kết quả trích ly. Chẳng hạn, đối với kích thước ngun liệu, q trình trích ly xảy ra chủ yếu do thẩm thấu và khuếch tán nên kích thước vật liệu càng nhỏ, diện tích tiếp xúc càng lớn và hiệu quả trích ly càng cao. Nguyên liệu phải được xay nhỏ đến mức thích hợp để dung mơi có điều kiện tiếp xúc trực tiếp với thành tế bào một cách dễ dàng, thúc đẩy q trình chiết xuất nhanh chóng và nâng cao hiệu suất chiết.
Với thời gian và nhiệt độ ly trích tối ưu đã chọn, tiếp tục khảo sát trạng thái nguyên liệu khi ly trích bằng cách cắt nguyên liệu thành 3 loại là cắt khoảng 10 mm, 5 mm và cắt nhỏ 1 mm nguyên liệu.
2.5.3. Xác định thành phần hóa học và hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) ký khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry)
Tiến hành phân tích mẫu tinh dầu được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC-MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N. Agilent Technologies HP 6890N ghép nối với Mass Selective Detector Agilent HP 5973 MSD.
Mẫu tinh dầu (25 𝜇L) pha trong 1,0 mL n-hexan, làm khan, tiêm mẫu: 1,0 𝜇L. Máy GC2.87 Agilent 6890N, MS 5973 inert.
Chương trình nhiệt cho mẫu: 50 oC giữ trong 2 phút sau đó tăng 2 oC/phút đến 80
oC, tăng 5 oC/ đến 150 oC, tiếp tục tăng 10 oC/phút đến 20 oC, tăng 20 oC/phút đến 300 oC giữ trong 10 phút.
Các cấu tử được xác định dựa trên dữ kiện phổ MS của chất rồi so sánh với phổ chuẩn trong thư viện Wiley/Chemstation HP.
2.5.4. Khảo sát một số chỉ số vật lý và hóa học 2.5.4.1. Xác định tỷ trọng 2.5.4.1. Xác định tỷ trọng
Tỷ trọng tương đối của tinh dầu tại 25 oC là tỷ số khối lượng tinh dầu ở 25 oC trên khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 25 oC. Tỷ trọng của tinh dầu dao động từ 0,7 - 1,2. Hầu hết tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn nước, trừ một vài tinh dầu như tinh dầu đinh hương, quế, long não…
Tỷ trọng tinh dầu thường phụ thuộc vào thành phần hóa học của tinh dầu. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất hydrocarbon thường có tỷ trọng nhỏ hơn 0,9. Những tinh dầu có chứa nhiều hợp chất chứa oxy thường có tỷ trọng lớn hơn 1. Ở 25 oC, nước có tỷ trọng 0,99823 g/mL.
Nguyên tắc: Tỷ trọng của tinh dầu được xác định bằng cách so sánh khối lượng tinh dầu và nước trong cùng một bình tỷ trọng ở 25 oC.
Tính kết quả:
=
Trong đó: m0 (gam): Khối lượng tỷ trọng kế rỗng. m1 (gam): Khối lượng tỷ trọng kế và nước. m2 (gam): Khối lượng tỷ trọng kế và tinh dầu.
Cách thực hiện:
+ Đầu tiên bình tỷ trọng phải được rửa sạch, tráng lại bằng etanol. Sấy khô. + Cân bình tỷ trọng rỗng (m0).
+ Cho nước cất vào đầy tới cổ bình, đậy nút, lau khơ phần nước trào. Cân khối lượng cả bình và nước cất (m1).
+ Thay nước cất bằng tinh dầu cũng theo cách thức như trên. Cân khối lượng cả bình và tinh dầu (m2).
2.5.4.2. Xác định chỉ số acid
Phương pháp xác định dựa trên sự trung hòa acid tự do trong chất thử dung dịch kiềm: RCOOH + KOH RCOOK + H2O
Hàm lượng acid được biểu thị bằng chỉ số acid nghĩa là lượng mg KOH cần để trung hòa 1 g chất thử hoặc biểu thị bằng phần trăm.
Chỉ số acid (IA) tính theo cơng thức:
IA = ∗ ,
Trong đó: V (mL): Số mL KOH 0,1N trong alcol đã dùng để chuẩn độ. m (g): Khối lượng mẫu tinh dầu.
5,61: Số mg KOH có trong 1 mL dung dịch KOH 0,1N trong alcol Cách tiến hành: Đầu tiên cân 1 g tinh dầu cho vào bình nón 50 mL, thêm vào 2,5 mL etanol, 3 giọt phenolphthalein. Trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch KOH 0,1N trên buret. Đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây và ghi nhận thể tích KOH đã dùng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ TRÍCH LY TINH DẦU BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHƯNG CẤT LƠI CUỐN HƠI NƯỚC CĨ HỖ TRỢ SÓNG SIÊU ÂM CUỐN HƠI NƯỚC CÓ HỖ TRỢ SĨNG SIÊU ÂM
Đã trích ly được tinh dầu hoa sứ với hàm lượng khoảng 0,058 % (tương đương 0,42 mL/500 g hoa sứ tươi). Tinh dầu hoa sứ thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có những đặc điểm sau:
Trạng thái: Chất lỏng màu vàng nhạt, trong suốt, nhẹ hơn nước. Mùi: Có mùi thơm đặc trưng của hoa sứ.
Hình 3.1. Tinh dầu hoa sứ
3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU SUẤT TRÍCH LY TINH DẦU HOA SỨ LY TINH DẦU HOA SỨ
3.2.1. Kết quả khảo sát thời gian trích ly
Tiến hành khảo sát thời gian trích ly trên 500 g mẫu hoa sứ tươi đã cắt nhỏ 1 mm. Thời gian được tính từ khi bắt đầu đến khi có tinh dầu. Kết quả được như Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát thời gian trích ly
Thời gian trích ly (phút) 60 90 120 150 180
Hàm lượng tinh dầu (%) 0,015 0,023 0,035 0,058 0,058 Từ kết quả bảng số liệu (Bảng 3.1), tiến hành xây dựng đồ thị biểu thị mối tương quan giữa thời gian trích ly và sự thay đổi tinh dầu thu được.
Hình 3.2. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hàm lượng tinh dầu
Nhận xét: Qua q trình khảo sát và phân tích số liệu ta thu được kết quả (Hình 3.2) cho thấy rằng khi thời gian trích ly tăng thì hàm lượng tinh dầu thu được cũng tăng. Nhưng sau 150 phút thì hàm lượng tinh dầu không thay đổi nữa.
Như vậy, hàm lượng tinh dầu thu được đạt cao nhất 0,058 % ở khoảng thời gian 150 phút, có nghĩa là trong 500 g hoa sứ tươi, hàm lượng tinh dầu chiếm 0,058 %.
Vậy 150 phút được chọn làm thời gian chưng cất tối ưu nhất. 3.2.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ trích ly
Tiến hành khảo sát nhiệt độ trích ly trên 500 g mẫu hoa sứ tươi đã cắt nhỏ 1 mm và đun trong 150 phút. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ trích ly
Nhiệt độ chưng cất (oC) 80 90 100
Hàm lượng tinh dầu (%) 0,022 0,043 0,051
0.015 0.023 0.035 0.058 0.058 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 60 90 120 150 180 H àm lư ợ ng t in h d ầu ( % )
Thời gian chưng cất (phút)
ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN TRÍCH LY ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH DẦU
Từ kết quả bảng số liệu (Bảng 3.2), tiến hành xây dựng đồ thị biểu thị mối tương quan giữa nhiệt độ trích ly và sự thay đổi tinh dầu thu được sau 150 phút.
Hình 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hàm lượng tinh dầu
Nhận xét: Qua q trình khảo sát và phân tích số liệu ta thu được kết quả (Hình 3.3) cho thấy với cùng khối lượng mẫu là 500 g, cùng trạng thái nguyên liệu cắt nhỏ 1 mm và thời gian khảo sát 150 phút, hàm lượng tinh dầu tăng dần từ 80 oC đến 100 oC. Vì vậy, nhiệt độ tối ưu trích ly tinh dầu hoa sứ là 100oC.
3.2.3. Kết quả khảo sát kích thước mẫu nguyên liệu trích ly
Tiến hành khảo sát kích thước mẫu nguyên liệu trích ly trên 500 g hoa sứ tươi. Chuẩn bị 3 phần hoa sứ, mỗi phần là 500 g hoa sứ có kích thước cắt lần lượt là 10 mm, 5 mm và 1 mm. Cố định nhiệt độ khoảng 100 oC và thời gian đun là 150 phút. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát kích thước mẫu nguyên liệu trích ly
Trạng thái nguyên liệu (mm) Hàm lượng tinh dầu (%)
Mẫu cắt khoảng 10 mm 0,027 Mẫu cắt khoảng 5 mm 0,038 Mẫu cắt khoảng 1 mm 0,056 0.022 0.043 0.051 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 80 90 100 H àm lư ợ ng t in h d ầu ( % ) Nhiệt độ chưng cất (oC)
ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ TRÍCH LY ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH DẦU
Từ số liệu Bảng 3.3, tiến hành xây dựng đồ thị biểu thị mối tương quan giữa kích thước nguyên liệu trích ly và sự thay đổi tinh dầu thu được sau đun 150 phút ở nhiệt độ khoảng 100 oC.
Hình 3.4. Đồ thị ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu Nhận xét: Qua q trình khảo sát và phân tích số liệu thu được kết quả (Hình 3.4) Nhận xét: Qua q trình khảo sát và phân tích số liệu thu được kết quả (Hình 3.4) cho thấy ở cùng nhiệt độ khảo sát là 100 oC, cùng thời gian khảo sát là 150 phút thì ngun liệu có kích thước càng nhỏ sẽ chiết được lượng tinh dầu càng nhiều. Do kích thước càng nhỏ thì diện tích bề mặt ngun liệu càng lớn nên lượng tinh dầu bị lơi cuốn theo hơi nước càng nhiều. Vì vậy kích thước tối ưu để trích ly tinh dầu hoa sứ là 1 mm.
Kết luận
Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thể tích tinh dầu gồm thời gian trích ly, nhiệt độ trích ly và kích thước mẫu đã chọn được điều kiện tối ưu thích hợp cho phương pháp chưng cất lơi cuốn hơi nước có hỗ trợ siêu âm để thu được thể tích tinh dầu cao nhất. Bảng 3.4. Điều kiện tối ưu để trích ly tinh dầu hoa sứ
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) Kích thước mẫu (mm)
150 phút 100 oC 1 mm 0.027 0.038 0.056 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 10 5 1 H àm lư ợ ng t in h d ầu ( % )
Kích thước nguyên liệu (mm)
ẢNH HƯỞNG CỦA KÍCH THƯỚC NGUYÊN LIỆU ĐẾN HÀM LƯỢNG TINH DẦU
3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU HOA SỨ Sau khi tiến hành xác định thành phần hóa học của tinh dầu hoa sứ bằng phương Sau khi tiến hành xác định thành phần hóa học của tinh dầu hoa sứ bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS, xác định được 25 hợp chất có trong tinh dầu hoa sứ. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Thành phần hóa học của tinh dầu hoa sứ
STT Tên chất Hàm lượng 1 Linalool 1,24 2 .alpha.-Terpineol 0,30 3 .cis-Geraniol 0,85 .beta.-Citronellol 4 .trans-Geraniol 1,65 5 Caryophyllene 0,14 6 .Humulene 0,08 7 -trans-Nerolidol 3,32 8 Caryophyllene oxide 0,50 9 beta.-Eudesmol 0,24 10 .alpha. -Eudesmol 0,27 11 8-Heptadecene 0,44 12 cis-Farnesol 2,34 13 .2-cis-6-trans-Farnesal 1,29 14 trans-Farnesol 9,07 15 2,6-trans-trans-Farnesal 2,71
16 Benzyl Benzoate (Ascabiol) 13,77
17 9-Nonadecene 1,53
18 Benzyl salicylic 49,24
20 Geranyl benzoate 2,27 21 Eicosane 0,93 22 Geranyl linalool 1,20 23 Heneicosene 0,70 24 Heneicosane 2,19 25 Tricosane 0,56
Bảng 3.6. Công thức cấu tạo của một số hợp chất chính trong tinh dầu hoa sứ
STT Tên chất CTCT
1 Benzyl salicylate
2 Benzyl Benzoate (Ascabiol)
3 trans-Farrnesol
Nhận xét: Từ bảng 3.5, thành phần tinh dầu hoa sứ thu được có 25 hợp chất, trong