bẫy cánh hoa hờng
Hình 3. 5. Nấm Phytophthora spp. trên mơi
trường PSM
3.1.4.2. Xác định loài Phytophthora dựa vào đặc điểm hình thái học
Hình thái của sợi nấm, của cành bọc bào tử, bọc bào tử, cách hình thành cành bọc bào tử, hình thái của hậu bào tử và phương thức sinh sản hữu tính, cách mọc của tản nấm trên các loại môi trường, kiểu dinh dưỡng, phổ ký chủ… là đặc điểm để định danh nấm
Phytophthora
Một số đặc điểm hình thái tế bào, khuẩn lạc của 3 lồi Phytophthora gây bệnh thối rễ chảy gơm cây có múi đã được mơ tả bởi Erwin & Ribeico (1996) và được tổng hợp
Bảng 3. 7. Một số đặc điểm hình thái và sinh học 3 lồi Phytophthora gây bệnh thối rễ chảy gơm
Đặc điểm P. nicotianae P. palmivora P. citrophthora
Sợi nấm phồng Hình dạng
Cầu, gần hình cầu, thường có sợi thứ cấp mọc ra
Cầu, gần hình cầu, kéo
dài, khơng đều Cầu, gần hình cầu (nhiều)
Cách hình thành Giữa sợi Dạng san hô, cụm, tụ tập
Cành bọc bào tử (Sporangiophore) Không phân nhánh hoặc dạng sim, thưa Dạng sim đơn, dài Dạng sim đơn, thưa, không
phân nhánh
Bọc bào tử
(Sporangium)
Cách hình thành trên cành bọc bào tử
Đơn độc hoặc dạng sim
đơn, thưa Dạng sim đơn, dày
Nội sinh từ bọc bào tử cũ, thành chuỗi;
Hình dạng
Cầu, trứng, trứng ngược, quả lê ngược, khơng đều; một số có phần đỉnh kéo dài, phần gốc thót nhọn
Cầu, trứng, elip, quả lê
ngược, không đều Trứng, elip, quả lê ngược
Kích thước (dài x rộng; µM) 15-46 x 11-38 42-77 x 24-40 24-40 x 9-16
Núm bọc bào tử Có, đơi khi có 2 núm Có Có
Bọc bào tử rụng khỏi cành bọc bào tử Không rụng hoặc có rụng với cuống ngắn (<5 µM) Có rụng với cuống ngắn (<5 µM) Có rụng với cuống ngắn (<5 µM) Hậu bào tử (Chlamydospore)
Hình dạng Cầu, gần hình cầu Cầu, gần hình cầu Cầu
Kích thước (µM) 15-43 16-50 x 16-45 16-43
Vị trí hình thành Bên sợi, đỉnh sợi, giữa sợi Đỉnh sợi, giữa sợi Đỉnh sợi, giữa sợi
Sinh sản hữu tính
Phương thức Dị tản Dị tản Dị tản
Cách bao đực (antheridium) giao phối bao trứng (oogonium)
Bao đực bao quanh cuống bao trứng (amphigynous)
Bao đực bao quanh cuống bao trứng (amphigynous)
Bao đực bao quanh cuống bao trứng (amphigynous)
Bào tử trứng (oospore) Phần lớn chốn khơng đầy
bao trứng (aplerotic)
Choán đầy (plerotic) hoặc gần đầy bao trứng
Choán đầy (plerotic) bao trứng
Phổ ký chủ Rộng (255 loài/90 họ) Rộng (>1000 loài) Rộng (~5000 loài)
Kiểu dinh dưỡng Bán sinh dưỡng Bán sinh dưỡng Bán sinh dưỡng
Khi phát triển trên môi trường PDA, tản nấm màu trắng, có dạng bơng xốp hoặc mịn hay có dạng hình cánh hoa, hệ sợi nấm không vách ngăn, phân nhánh, sợi nấm xoăn có dạng cành cây nổi lên từng cụm, hình thành nhiều u nhỏ. Bọc bào tử có hình cầu, hình elip, hình trứng có khi dạng hình thang lệch. Bọc bào tử có từ một đến 2 núm rõ ràng, đính trên đỉnh cành bọc bào tử. Bọc bào tử trưởng thành phóng bào tử động (zoospore) thơng qua lỗ hở, bào tử động có 2 lơng roi ở 2 đầu, kích thước nhỏ 7-10 µm. Bào tử vách dày (chlamydospora) hình cầu có kích thước từ 28-35µm. Các mẫu phân lập được trên cam, quýt, bưởi cũng như tại các vùng khác nhau có đặc điểm hình thái khác nhau.
Đặc điểm phát triển của tản nấm, hình thái cành bọc bào tử, bọc bào tử và hậu bào tử của nấm, đã được sử dụng để xác định các loài nấm Phytophthora gây hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng.
Hình 3. 6. Các loài nấm Phytophthora hại trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng
A – Sợi nấm P.palmivora; B – Sợi nấm P. citrophthora; C – Sợi nấm P. nicotianae; D – Bọc bào tử nấm P.palmivora; E – Bọc Bào tử nấm P. citrophthora; D – Bọc Bào tử nấm
P. nicotianae.
Sự phát triển của 142 nguồn nấm Phytophthora trên môi trường PDA được chia
thành 3 nhóm khác nhau. Nhóm (1) Tản nấm phát triển dạng bơng, tản nấm có màu trắng hơi trong trên môi trường V8, trên môi trường PDA, màu trắng đục. Nhóm (2) tản nấm phát triển dạng bông mịn, màu trắng hơi trong trên môi trường V8 và trên môi trường PDA
trên môi trường V8, trên mơi trường PDA tản nấm phát triển hình cánh hoa đặc trưng, màu trắng. Nấm ở nhóm 2 có nhiều nhất 49,29% mẫu nấm và phân bố khá đều ở các vùng điều tra, nấm ở nhóm 1 có it nhất chỉ 20,24% mẫu chủ yếu phân lập được từ các mẫu thu ở Trà Lĩnh và Hòa An (bảng 3.8).
Bảng 3. 8. Các nhóm hình thái phát triển tản nấm của các mẫu nấm trên môi trường V8 và môi trường PDA (Năm 2014 – 2015)
Nhóm Hình thái tản nấm
Số mẫu phân lập được tại các địa điểm
Trà Lĩnh Hòa An Thạch An Ngun Bình Phục Hịa Tổng số Tỷ lệ (%) 1 Tản nấm phát triển dạng bơng mịn, tản nấm có màu trắng hơi trong trên môi trường V8 trên môi trường PDA hơi có dạng cánh hoa, màu trắng
8 8 3 6 4 29 20,42
2
Tản nấm phát triển dạng bông xốp, màu trắng nhạt trên môi trường V8 và trắng đục trên môi trường PDA
16 14 12 13 15 70 49,29
3
Tản nấm phát triển dạng bông màu trắng hơi phớt hồng trên môi trường V8, trên môi trường PDA tản nấm phát triển hình cánh hoa đặc trưng, màu trắng
11 7 9 6 10 43 30,29
Tổng số 35 29 24 25 29 142 100
Mười nguồn nấm đại diện cho 3 nhóm đã được lựa chọn để nghiên cứu xác định nấm dựa trên cách mọc của tản nấm đặc điểm hình thái của sợi nấm của, cành bọc bào tử, bọc bào tử và của hậu bào tử.
Nhóm 1
PDA hơi có dạng cánh hoa, màu trắng. Sợi nấm trong suốt, khơng vách ngăn, ít phân nhánh và hơi phình lên ở vị trí phân nhánh. Cành bào tử ít phân nhánh, các bọc bào tử đính trên đỉnh cành hay đỉnh nhánh của cành bào tử. Bọc bào tử thường có núm, hình elip, hình trứng, nhưng phổ biến dạng quả lê, kích thước bọc bào tử từ 42,6-76,6 µm x 22,8-41,4 µm. Bọc bào tử có cuống ngắn, kích thước từ 3,6 đến 4,8 µm. Theo khóa phân loại của Erwin và Ribeico (1996) hai mẫu Phyt-01 và Phyt-02 được xác định là nấm Phytophthora palmivora.
Bảng 3. 9. Kích thước bọc bào tử của các loài nấm Phytophthora
(Năm 2015 – 2016)
Loài nấm Ký chủ Kích thước bọc bào tử
Tỉ lệ
Dài (µm) Rợng (µm)
P.palmivora (Phyt-01) Quýt Trà Lĩnh 42.4-76.6 26.5-38.7 1.8
P.palmivora (Phyt-02) Quýt Trà Lĩnh 45.5-75.6 22.8-41.4 1.8
Trung bình 43,9 – 76,1 24,6-40.3 1.8
P.nicotianae (Phyt-03) Quýt Trà Lĩnh 13.4-44.3 16.4-39.4 1,0
P.nicotianae (Phyt-04) C. Trưng Vương 16.2-48.5 13.3-36.5 1.3
Trung bình 14,8 - 46.4 14.5-38.3 1.2
P. citrophthora (M1) Quýt Trà Lĩnh 24.1-42.2 9.3-17.3 1.72
P. citrophthora (M2) Quýt Trà Lĩnh 21.3-36.3 8.3-15.2 1.80
P. citrophthora (M3) C. Trưng Vương 27.5-43.3 7.9-14.4 1.64
P. citrophthora (M4) C. Trưng Vương 25.3-37.2 8.4-18.2 1.89
P. citrophthora (M5) Bưởi Phục Hòa 28.4-45.3 8.2-15.3 1.79
P. citrophthora (M6) Bưởi Phục Hòa 21.2-37.6 9.5-17.5 1.88
Trung bình 24.6-40.3 8.6-16.3 1.79
Nhóm 2
Hai mẫu Phyt-03 (phân lập từ quýt Trà Lĩnh) và Phyt-04 (phân lập từ cam Trưng Vương) có tản nấm phát triển dạng bông xốp, màu trắng nhạt trên môi trường V8 và trắng đục trên môi trường PDA. Sợi nấm trong suốt, khơng vách ngăn, hơi phình lên. Bọc bào tử dạng hình cầu, hình trứng, có núm. Kích thước trung bình của bọc bào tử thay đổi từ 15,2-
quan sát. Theo khóa phân loại của Erwin và Ribeico (1996), các mẫu Phyt-03 và Phyt-04 thuộc về nấm Phytophthora nicotianae.
Nhóm 3
Các mẫu nấm M1và M2 (phân lập từ quýt Trà Lĩnh), M3và M4 (phân lập từ cam Trưng Vương), M5 và M6 (phân lập từ bưởi Phục Hòa) tản nấm có dạng bơng màu trắng và có thể phớt hồng trên mơi trường V8, trên mơi trường PDA tản nấm có dạng cánh hoa, màu trắng. Sợi nấm khơng vách ngăn, phân nhánh. Bọc bào tử hình elip, hình trứng, hình quả chanh và một số trường hợp có hình dạng méo và không đối xứng, bọc bào tử được sinh ra từ đoạn cuối cành bào tử, bọc bào tử có 1-2 núm. Bọc bào tử có kích thước từ 24,6- 40,3 µm x 8,6-16,3 µm. Các đặc điểm hình thái sợi nấm và bọc bào tử của các mẫu M1 M2, M3, M4, M5 và M6 tương tự như mô tả của Erwin và Ribeico (1996), của Hamm và Hansen (1987) về nấm Phytophthora citrophthora.
Hình 3. 7. Hình thái tản nấm của P. nicotianae và P. palmivora trên môi trường nuôi
cấy nhân tạo (sau 7 ngày, 28oC)
Hình 3. 8. Hình thái tản nấm của P. citrophthora trên môi trường PDA
3.1.4.3. Xác định loài Phytophthora bằng kỹ thuật PCR
Để xác định chính xác tác nhân gây bệnh thối gốc, chảy gôm, các mẫu nấm phân lập được từ các triệu chứng bệnh điển hình trên các giống cây có múi đã được giải trình tự vùng liên kết gen ITS (internally transcribed spacers).
Cặp mồi ITS4 và ITS5 đã được sử dụng để xác định các mẫu nấm Phytophthora
gây bệnh trên cây ăn quả có múi tại Cao Bằng
ITS4: 5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ ITS5: 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’
Phản ứng PCR nhân vùng gen mã vạch ITS của các mẫu Phytophthora đã được
thực hiện với cặp mồi ITS4 và ITS5. Sản phẩm PCR có kích thước xấp xỉ 0.8 kb, đã được tinh chiết từ gen agarose và được giải trình tự trực tiếp (Hình 3.9)
Hình 3. 9. PCR nhân vùng gen ITS của các mẫu Phytophthora
(Các giếng từ 1 đến 10) bằng cặp mồi ITS4 và ITS5. M là thang DNA 1 kb (GeneRuler 1 kb, Thermo).
Nhóm 1: mẫu Phyt-01 và mẫu Phyt-02
Hai mẫu Phyt-01 và Phyt-02 có sản phẩm PCR giống nhau với kích thước là 795 bp. So sánh trình tự gen trên GenBank tại NCBI xác định mẫu Phyt-01 và Phyt-02 thuộc loài P. palmivora (Bảng 3.10).
Dựa trên kết quả tìm kiếm Genbank phân tích phả hệ đã được thực hiện. Kết quả phân tích phả hệ cho thấy 2 mẫu Phyt-01 và Phyt-02 thuộc về nhóm lồi P.palmivora (giá trị thống kê boostrap của cụm bằng 99) (Hình 3.10)
Bảng 3. 10. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 2 mẫu
Phytophthora, Phyt-01 và Phyt-02, dựa trên trình tự ITS (Năm 2015)
STT Loài xác định Phần trăm đoạn
so sánh (%) Mức đồng nhất trình tự (%) Mã GenBank 1 P. palmivora 100 99.9 MT052675 2 P. palmivora 100 99.9 MK500842 3 P. palmivora 100 99.9 MH401199 4 P. palmivora 100 99.9 MF370566 5 P. palmivora 100 99.9 MG434772 Ghi chú: chỉ trình bày 5 trình tự gần nhất
Hình 3. 10. Cây phát sinh dựa trên trình tự tồn bợ vùng ITS của các mẫu
Phytophthora Phyt-01 và Phyt-02 với các lồi có quan hệ họ hàng gần
Nhóm 2 : Mẫu Phyt-03 và mẫu Phyt-04
Bảng 3. 11. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 2 mẫu
Phytophthora, Phyt-03 và Phyt-04, dựa trên trình tự ITS (Năm 2015)
STT Loài xác định Phần trăm đoạn
so sánh (%) Mức đồng nhất trình tự (%) Mã GenBank 1 P. nicotianae 99 99.9 KR827692 2 P. nicotianae 99 99.9 KJ865230 3 P. nicotianae 99 99.9 JF792541 4 P. nicotianae 99 99.9 JF792540 5 P. nicotianae 99 99.9 GU111681 Ghi chú: chỉ trình bày 5 trình tự gần nhất
Hình 3. 11. Cây phát sinh dựa trên trình tự tồn bợ vùng ITS của 2 mẫu
Phytophthora Phyt-03 và Phyt-04 với các lồi có quan hệ họ hàng gần
Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining sử dụng mơ hình thay thế Kimura 2 tham số để ước lượng khoảng cách di truyền (thanh bar). Giá trị ở các nốt là giá
Hai mẫu Phyt-03 và Phyt-04, có sản phẩm PCR kích thước bằng 824 bp. Phân tích trình tự cho thấy cả 2 mẫu Phyt-03 và Phyt-04 đều có mức trình tự đồng nhất trình tự 100% với nhau. Trình tự của các mẫu được sử dụng để tìm kiếm chuỗi gần gũi trên GenBank tại NCBI. Kêt quả tìm kiếm cho thấy lồi gần gũi nhất là P. nicotianae (Bảng
3.11).
Dựa trên kết quả tìm kiếm Genbank, phân tích phả hệ đã được thực hiện. Kết quả phân tích phả hệ cho thấy 2 mẫu Phyt-03 và Phyt-04 thuộc về nhóm lồi P. nicotianae (giá trị thống kê boostrap của cụm bằng 100%) (hình 3.11)
Theo các đặc điểm hình thái các mẫu Phyt-03 và Phyt-04 đã được xác định là nấm
P.nicotianae kết quả này hoàn toàn trùng khớp với các kết quả xác định nấm theo phương
pháp PCR
Nhóm 3: Mẫu M1 đến M6
Sản phẩm PCR của sáu mẫu từ M1 tới M6 đã được giải trình tư trực tiếp sau khi loại bỏ các trình tự nhiễu ở 2 đầu, đoạn đọc được của 6 mẫu đều có kích thước bằng 811bp.
Phân tích trình tự cho thấy cả 6 mẫu đều có mức trình tự đồng nhất trình tự 100% với nhau. Tiếp theo, trình tự của các mẫu được sử dụng để tìm kiếm chuỗi gần gũi trên GenBank tại NCBI. Kêt quả tìm kiếm cho thấy lồi gần gũi nhất là P. citrophthora (Bảng 3.12).
Bảng 3. 12. Kết quả tìm kiếm trình tự gần gũi trên GenBank của 6 mẫu Phytophthora
(M1 – M6) dựa trên trình tự ITS (Năm 2015)
STT Loài xác định Phần trăm đoạn
so sánh (%) Mức đồng nhất trình tự (%) Mã GenBank 1 P. citrophthora 100 100 GU111603 2 P. citrophthora 100 100 GU111602 3 P. citrophthora 100 100 GU111601 4 P. citrophthora 100 100 GU111600 5 P. citrophthora 100 99.6 GU133066
Dựa trên kết quả tìm kiếm Genbank, phân tích phả hệ đã được thực hiện. Kết quả phân tích phả hệ cho thấy cả 6 mẫu từ M1 đến M6 phân nhóm rõ rệt trong cụm lồi P. citrophthora (giá trị thống kê boostrap của cụm bằng 100%).
Hình 3. 12. Cây phát sinh dựa trên trình tự tồn bợ vùng ITS của 6 mẫu
Phytophthora (M1, M2 M3, M4, M5, M6) với đại diện các loài Phytophthora trên
GeneBank
Cây được xây dựng bằng phương pháp Neighbor-Joining sử dụng mơ hình thay thế Kimura 2 tham số để ước lượng khoảng cách di truyền (thanh bar). Giá trị ở các nốt là giá
Theo các đặc điểm hình thái các mẫu M1, M2, M3, M4, M5 và M6 đã được xác định là nấm P.citrophthora kết quả này hoàn toàn trùng khớp với các kết quả xác định nấm theo phương pháp PCR.
Kết quả xác định nấm dựa theo các đặc điểm hình thái hồn tồn trùng khớp với các kết quả xác định nấm theo phương pháp PCR. Trên các mẫu đất và cây bị bệnh thu thập được từ các vùng trồng cây ăn quả có múi của Cao Bằng đã phân lập được 3 loài nấm
P. citrophora, P. palmivora và P. nicotianae.
Kết quả phân lập và giám đã chỉ ra các loài P. nicotianae và P. citrophora là các tác nhân chủ đạo gây bệnh trên cây có múi ở Cao Bằng
Khả năng gây bệnh của 10 mẫu nấm Phytophthora hại cây có múi phân lập được ở Cao Bằng đã được đánh giá tại phòng thí nghiệm và nhà lưới của Viên Bảo vệ thực vật trong 2 năm 2015-2016 trên quả và cây non cam Trưng Vương.
3.1.4.4. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả cam Trưng Vương
Lây nhiễm bệnh nhân tạo trên quả cam Trưng Vương chín sinh lý bằng cách áp miếng vải màn nhúng trong dịch nấm 2 x 105 bào tử/ml của với 03 loài nấm P. palmivora,
P. nicotianae và P. citrophthora vào mặt quả cam, giữ ẩm và đặt trong tối ở nhiệt độ từ 26
- 280C. Cả 10 mẫu nấm đều có khả năng lây bệnh cho quả cam Trưng Vương. Triệu chứng bệnh xuất hiện cả ở 10 mẫu thí nghiệm sau 5 - 8 ngày lây nhiễm. Vùng quả bị nhiễm bệnh có màu nâu, sau đó thâm đen, vỏ quả xung quanh chỗ nhiễm bệnh hơi cứng, vết bệnh bị thối sau 10 - 15 ngày. Tuy nhiên các mẫu nấm khác nhau khả năng gây bệnh cho quả cam có khác nhau. Các mẫu nấm Phyt-02 (P. palmivora), M4, M5 và M6 (P. citrophthora) thời gian tiềm dục của bệnh chỉ có 5 - 6 ngày, Trong khi đó các mẫu Phyt-03 và Phyt-04 (P.
nicotianae) thời gian tiềm dục của bệnh kéo dài tới 7 - 8 ngày. Khả năng gây bệnh cho quả
cam Trưng Vương của các mẫu nấm thuộc loài P. palmivora, P. citrophthora đạt từ 70 - 90%, đặc biệt mẫu M3 (P. citrophthora) phân lập từ cam Trưng Vương có khả năng gây bệnh cao nhất cho quả cam Trưng Vương (90%). Khả năng gây bệnh cho quả cam Trưng Vương của loài P. nicotianae thấp hơn chỉ 60% số quả thí nghiệm bị nhiễm bệnh (bảng
Bảng 3. 13. Kết quả lây bệnh nhân tạo trên quả cam Trưng Vương của các loài nấm Phytophthora. (Năm 2015 – 2016) TT Mẫu Nấm