VÀ KỸ THUẬT ELISA
1.5.1. Kỹ thuật gõy mẫn cảm
Quỏ trỡnh mẫn cảm tạo khỏng thể thỏ
Khi tiờm dung dịch chứa KN tinh trựng vào cơ thể thỏ, hệ miễn dịch của thỏ sẽ nhận diện và xử lý KN tinh trựng bằng cỏc APC. . Cỏc APC sau khi xử lý KN sẽ trỡnh diện epitop KN liờn kết phõn tử MHC II cho tế bào lympho T tại cỏc hạch lympho gần nhất, lỳc này tế bào lympho T sẽ tiết ra IL-2 để hoạt hoỏ tế bào lympho B.
Tế bào lympho B sau khi nhận biết KN trỡnh diện cho Th, sẽ tăng sinh, biệt hoỏ thành nguyờn tương bào, tế bào lympho B sẽ phỏt triển thành những quần thể đến cỏc hạch trong toàn cơ thể. Nguyờn tương bào chuyển thành tế bào plasma (tương bào), bắt đầu sản xuất KT lưu hành trong huyết thanh thỏ, đú là KTCTT. Theo dừi trờn lõm sàng, do tỏc dụng của KT, ở thỏ khi cú đỏp ứng miễn dịch ta cú thể thấy hiện tượng viờm do KT hoạt húa bổ thể. Một số tế bào lympho B chuyển thành tế bào nhớ cho đỏp ứng lần sau. Đú chớnh là quỏ trỡnh đỏp ứng miễn dịch dịch thể
Lần thứ hai, thứ ba và thứ 4 tiờm KT TT vào cơ thể thỏ, hiện tượng đỏp ứng miễn dịch của thỏ diễn ra càng sau càng mạnh hơn , kộo dài hơn và sớm hơn.
Sau quỏ trỡnh tạo mẫn cảm KT thỏ, khi thu hoạch huyết thanh, ta cú thể thu được huyết thanh thỏ cú KTCTT với nồng độ cao, dựng để làm chứng dương cho nghiờn cứu
Kỹ thuật gõy mẫn cảm
Ngày nay, phương phỏp miễn dịch sử dụng khỏng thể đó trở thành khụng thể thiếu được trong nghiờn cứu và chẩn đoỏn dựa trờn cỏc đặc tớnh liờn kết KN đặc hiệu và tớnh ổn định cao. Từ hơn một thế kỷ trước, cỏc nghiờn cứu của Emil Behring và Shibasaburo Kitasato đó cho thấy cú thể thu nhận cỏc phõn tử liờn kết đặc hiệu từ mỏu. Kể từ đú, cỏc KT cú tớnh đặc hiệu cụ thể đó được sản xuất bằng cỏch sử dụng một KN để gõy miễn dịch trờn cỏc động vật thớ nghiệm. Một vài tuần sau khi gõy miễn dịch, KT mong muốn được phỏt hiện trong huyết thanh của động vật (kể cả người).
Với sự phỏt triển cụng nghệ sinh học, cho đến nay đó cú 3 hướng tạo KT: - Khỏng huyết thanh chứa cỏc KT đa dũng.
- Cỏc tế bào lympho B bất tử sản xuất KT đơn dũng.
Nguyờn lý tiến hành kỹ thuật :
Dựa vào quỏ trỡnh tạo miễn dịch dịch thể ta sẽ tiờm vào cơ thể cần gõy mẫn cảm nhiều lần để tạo được ĐƯMD như mong muốn.
Mỗi lần thực hiờn, KT sẽ được trộn với được trộn với tỏ chất đặc biệt tiờm dưới da ở nhiều vị trớ khỏc nhau. Cỏc lần tiờm cỏch nhau 01 tuần, hay 1 thỏng. Việc trộn KN với tỏ chất nhằm tạo ra một phản ứng viờm, giải phúng từ từ KN vào cơ thể thỏ và làm cho KN dễ bị bắt rồi được trỡnh bày cho cỏc tế bào lympho T và B bởi cỏc tế bào trỡnh diện KN. Sau 07 đến 10 ngày kể từ lần gõy miễn dịch cuối cựng huyết thanh mẫn cảm được thu thập. Theo động học của quỏ trỡnh tạo KT, đõy là thời điểm nồng độ KT trong mỏu là cao nhất. Sau đú sử dụng cỏc kỹ thuật miễn dịch để xỏc định sự xuất hiện KT trong huyết thanh đối tượng được gõy mẫn cảm.
1.5.2. Kỹ thuật ngưng kết
Hỡnh 1.4: a,b: tinh trựng ngưng kết, c: tinh trựng khụng ngưng kết
Nguyờn tắc của kỹ thuật ngưng kết dựa vào phản ứng ngưng kết của KN-KT. Tiờu biểu cho kỹ thuật ngưng kết là xột nghiệm tỡm nhúm mỏu.
Trong thử nghiệm về KTCTT, tinh trựng là cỏc tế bào trờn bề mặt mang cỏc dấu ấn KN. Ta dựng một mẫu huyết thanh làm chứng dương, đú là mẫu huyết thanh được chế tạo từ kỹ thuật gõy mẫn cảm, một mẫu làm chứng õm (cú thể dựng nước muối sinh lý). Khi huyết thanh của người vợ cú KTCTT, KT trong huyết thanh người vợ sẽ kết hợp với khỏng nguyờn trờn bề mặt của
tinh trựng chồng, tinh trựng tạo thành phức hợp KN-KT, chỳng “cụm lại” mất khả năng di chuyển hay chớnh là “ngưng kết”
Dựng kỹ thuật ngưng kết tinh trựng Franklin-dukes (F-D test) [8]
Điều kiện tiờn quyết để ỏp dụng F-D test : nồng độ tinh trựng ớt nhất khoảng 20*106 / ml, pha loóng với đệm Baker và huyết thanh cũng phải được pha loóng với đệm Baker, bắt đầu từ tỷ lệ 1:4. Cỏc F-D test chỉ cho phộp đỏnh giỏ chất lượng của KTCTT cú thể gõy ngưng kết tinh trựng qua thụng định tớnh phần trăm tinh trựng ngưng kết. Do đú cỏc thụng số của cỏc F-D test vẫn cú thể dao động và khụng cú con số cụ thể.
1.5.3. Kỹ thuật Elisa
Vào năm 1960, thấy rằng phương phỏp miễn dịch cú gắn chất phúng xạ tiềm ẩn mối nguy hiểm vỡ vậy người ta nghĩ đến một phương phỏp mới trong đú tớn hiệu được phỏt ra khụng phải nhờ phúng xạ. Khi đú người ta biết rằng một số loại enzyme như cỏc peroxidase phản ứng với một số cơ chất nhất định như Tetramethylbenzidine sẽ phỏt màu. Màu sinh ra từ cỏc phản ứng này cú thể được sử dụng làm tớn hiệu nhận biết (tớn hiệu chỉ thị). Nhưng tớn hiệu màu phỏt ra phải đồng nghĩa với sự cú mặt của KT hay KN. Giải phỏp được đưa ra là enzyme sẽ được gắn với KN hay KT và phương phỏp gắn KN và KT trờn bề mặt rắn (bề mặt của cỏc vi phiếm hay cỏc đĩa, nhờ đú mà KN hay KT khụng được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa trụi )
Vào năm 1971, dựa trờn tất cả những bước phỏt triển núi trờn, Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) cựng với nhúm Anton Schuurs và Bauke van Weemen (Hà Lan) cụng bố phương phỏp được đặt tờn ELISA.
Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: KN, KT và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước [4]
− Phản ứng húa học: Thụng qua hoạt tớnh xỳc tỏc của enzyme làm giải phúng oxy nguyờn tử từ H2O2 để oxy húa cơ chất chỉ thị màu, do đú làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thớ nghiệm.
Cỏch tiến hành:
− Phủ KN hay KT lờn đỏy ống nghiệm hay cỏc giếng của phiến nhựa (bằng chất cao su cao phõn tử để gắn chặt)
− Sau đú phủ tiếp huyết thanh nghi ngờ cú KT hay KN đặc hiệu lờn, rửa bỏ KT hay KN thừa,
− Phủ tiếp KT đỏnh dấu (enzym) rồi rửa tiếp − Cuối cựng phủ cơ chất lờn.
− Emzym cũn lại, do KT đỏnh dấu kết hợp làm đổi màu cơ chất. Dựa vào sự đổi màu đú ta cú thể xỏc định được sự cú mặt của KN hay KT tương ứng. người ta cũng cú thể dựa vào mức độ đổi màu của cơ chất để định lượng KN hay KT trong mẫu thử
Phõn loại Elisa
− ELISA trực tiếp : Đõy là dạng đơn giản nhất của phương phỏp. Trong đú, KN cần phỏt hiện sẽ được gắn trực tiếp lờn bề mặt giỏ thể và sẽ được phỏt hiện bằng một KT duy nhất (KTnày đó được gắn enzyme). − ELISA giỏn tiếp hay ELISA cạnh tranh: Phương phỏp này khỏc ELISA
trực tiếp ở chỗ khỏng thể bắt khỏng nguyờn khụng được gắn enzyme mà nú là mục tiờu gắn đặc hiệu của một KT khỏc (KT này mới là KT được gắn với enzyme).
− Sandwich ELISA: Đõy là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nú cho phản ứng mạnh và nhạy. Được gọi là “sandwich” là do kết quả thớ nghiệm được đỏnh giỏ thụng qua sự kết hợp của hai loại KT là KT bắt và KT phỏt hiện
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng nghiờn cứu
Đối tượng là thỏ : 3 thỏ, to, khỏe, cõn nặng từ 2-2,5kg
Đối tượng là bệnh nhõn được xỏc định là vụ sinh, đó loại trừ cỏc nguyờn nhõn khỏc và nghi ngờ do miễn dịch, cú chỉ định làm xột nghiệm tỡm KTCTT tại bộ mụn miễn dịch-sinh lý bệnh trường đại học Y Hà Nội
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Thiết kế nghiờn cứu
Nghiờn cứu mụ tả cắt ngang
2.2.2. Cỏc bước nghiờn cứu
− Nghiờn cứu gõy mẫn cảm thỏ + Chọn đối tượng nghiờn cứu + Gõy mẫn cảm thỏ
+ Thu hoạch huyết thanh và định lượng KT bằng kỹ thuật Elisa − Xỏc định KTCTT ở cỏc cặp vợ chồng nghi ngờ vụ sinh do miễn
dịch
+ Chọn đối tượng nghiờn cứu + Thu thập thụng tin về đối tượng:
Tờn
Giới
Tuổi
+ Lấy mỏu tĩnh mạch đối tượng cần nghiờn cứu, tỏch huyết thanh, khử bổ thể
+ Xỏc định nồng độ KTCTT trong huyết thanh đối tượng nghiờn cứu bằng kỹ thuật Elisa [16]
Dương tớnh (+) khi nồng độ KTCTT trong huyết thanh trờn 60 UI/ml
Âm tớnh (-) khi nồng độ KTCTT trong huyết thanh từ 0-60 UI/ml
− Xỏc định KTCTT bằng ngưng kết + Chọn đối tượng
+ Lấy huyết thanh vợ và TT chồng
+ Sử dụng kỹ thuật ngưng kết Frankin-Duker (F-D test) [16] để xỏc đinh huyết thanh người vợ trực tiếp gõy ngưng kết tinh trựng chồng là bao nhiờu phần trăm, xỏc định mức độ ngưng kết + Kết quả được xem là dương tớnh khi toàn bộ số tinh trựng
ngưng kết cũn hoạt động trờn toàn bộ số tinh trựng hoạt động, tỷ số này phải >10%
2.2.3. Cỏc kỹ thuật nghiờn cứu
Kỹ thuật gõy mẫn cảm − Chọn đối tượng thỏ
− Mẫu tinh dịch của nhiều người (cú số lượng TT từ 60.106 TT/ml trở lờn) độ hoạt động của TT trờn 70%, trộn đều với nhau
− KN TT người được trộn đều với tỏ chất tạo thành một hỗn dịch đục trắng như sữa, quỏnh và khụng tan trong nước trong vũng 10 phỳt. Trong đú, lần tiờm thứ nhất và thứ ba dựng với tỏ chất Freund hoàn toàn; lần tiờm thứ hai và thứ tư với tỏ chất Freund khụng hoàn toàn − Tiờm dưới da ở nhiều vị trớ khỏc nhau dọc theo cột sống. Việc trộn
khỏng nguyờn với tỏ chất Freund nhằm tạo ra một phản ứng viờm, giải phúng từ từ khỏng nguyờn vào cơ thể thỏ và làm cho khỏng
nguyờn dễ bị bắt rồi được trỡnh bày cho cỏc tế bào lympho T và B bởi cỏc tế bào trỡnh diện khỏng nguyờn
− Bốn lần tiờm cỏch nhau 1 tuần
− Sau 7- 10 ngày kể từ lần gõy miễn dịch cuối cựng huyết thanh thỏ được thu thập, lấy mỏu thỏ qua động mạch cảnh. Theo động học của quỏ trỡnh tạo khỏng thể, đõy là thời điểm nồng độ khỏng thể trong mỏu là cao nhất.
− Sau đú ly tõm tỏch huyết thanh. Huyết thanh thỏ được đụng khụ và cất giữ ở -20 độ C.
− Xỏc định sự xuất KTCTT trong huyết thanh thỏ bằng kỹ thuật miễn dịch Elisa
1 tuần 1 tuần
1 tuần
7-10 ngày
Hỡnh 2.1: Mụ hỡnh quy trỡnh gõy miễn dịch tạo KTCTT ở thỏ
Kỹ thuật Elisa
+ Chứng (+) Giếng A cho 50 àl standard 2 (31 U/ml) + Chứng (+) Giếng B cho 50 àl standard 4 (62 U/ml) + Chứng (+) Giếng C cho 50 àl standard 2 (125 U/ml) + Chứng (+) Giếng D cho 50 àl standard 2 (250 U/ml) + Chứng (-) Cho thờm 50 àl zerostandard
+ Giếng F: cho vào mỗi giếng 50 àl huyết thanh bệnh nhõn + Dỏn kớn miệng giếng
− Ủ 370 C trong 60 phỳt
− Rửa chương trỡnh KTTT3 (ủ 5 lần, mỗi lần 800μl) − Cho tiếp 50 àl emzym vào tất cả cỏc giếng (cojugate) − Ủ 370 C trong 60 phỳt
− Rửa chương trỡnh KTTT5 (ủ 5 lần, mỗi lần 800μl) − Thờm 50 àl substrate solution
− Ủ nhiệt độ phũng 30 phỳt − Nhỏ 50 àl stopsolution − Đo bằng mỏy
Kỹ thuật ngưng kết
Dựng kỹ thuật ngưng kết tinh trựng Franklin-dukes (F-D test) − Chọn đối tượng Tinh dịch của chồng:
+ Lấy tinh dịch của người chồng
+ Pha loóng với dung dịch đệm Baker [16] tới mật độ 50.106 TT/ml
− Huyết thanh vợ:
+ Lấy mỏu từ tĩnh mạch, ly tõm tỏch huyết thanh + Khử bổ thể ở 560C trong vũng 30 phỳt
− Huyết thanh thỏ: khử bổ thể ở 560C trong vũng 30 phỳt − Quỏ trỡnh thực hiện Bất hoạt 560C/30 phỳt Đệm Tinh dịch đó pha loóng ủ Chứng + 100àl Ht thỏ chống TT người 300àl 50àl 370C Chứng - 100àl nước muối sinh lý 300àl 50àl 370C Mẫu HT thử 100àl Ht cần thử 300àl 50àl 370C
- Tại thời điểm sau 1 giờ, từ mỗi ống lấy ra một giọt, soi trờn kớnh hiển vi thường
- Kết quả đỏnh giỏ : số TT ngưng kết cú khả năng hoạt động trờn toàn bộ số TT cú khả năng hoạt động, dương tớnh khi trờn 10%
2.3. Thời gian nghiờn cứu
Thời gian nghiờn cứu được thực hiện song song với quỏ trỡnh thu thập mẫu nghiờn cứu từ 9/11/2011 đến 3/5/2012
Địa điểm nghiờn cứu: bộ mụn Miễn dịch - Sinh lý bệnh đại học Y Hà Nội
2.4. Xử lý số liệu
Chương 3 KẾT QUẢ