Phương pháp Đặc điểm
In vivo Nghiên cứu trên cơ thể sinh vật (ngƣời, chuột, thỏ, khỉ, …)
In vitro
Nghiên cứu trong ống nghiệm trên các vi sinh vật (vi khuẩn, vi nấm) hay các cơ quan, mô, tế bào…, đã đƣợc phân lập khỏi cơ thể sinh học;
In situ
Nghiên cứu tại chỗ hay nghiên cứu nội vi, tiến hành trên các mô, tế bào, …, ngay trong cơ thể sinh vật (không bị phân lập); đƣợc coi là phƣơng pháp trung gian giữa in vivo và in vitro.
1.5.2. Hiệu ứng sinh học và các dạng hoạt tính trong nghiên cứu QSAR
Nhƣ đã biết, các hiệu ứng sinh học là kết quả của một hệ tƣơng tác phức tạp và đƣợc quy định bởi rất nhiều tác nhân bao gồm các tác nhân bên ngoài từ nhiều nguồn phơi nhiễm và các tác nhân bên trong từ đặc thù riêng của mỗi cá thể sinh học. Để thiết lập mối quan hệ định lƣợng trong nghiên cứu QSAR, các hiệu ứng sinh học đƣợc quy chuyển thành các dạng thơng số hoạt tính dƣới dạng các số liệu cụ thể về nồng độ hoạt chất gây ra các đáp ứng sinh học nhất định. Một số dạng thơng số hoạt tính đƣợc sử dụng phổ biến trong nghiên cứu QSAR đƣợc trình bày ở Bảng 1.5.
Bảng 1.5. Một số dạng thơng số hoạt tính thường được sử dụng trong nghiên cứu QSAR
EC50 Half maximal effective
concentration Nồng độ cho 50% tác dụng tác dụng tối đa ED50 Median Effective Dose Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử
IC50 Half maximal inhibitory
concentration Liều cho tác dụng tối đa trên 50% thú thử SD50 Median Supression Dose Liều tiêu diệt 50% đối tƣợng thử
LD50 Median lethal dose Liều gây chết 50% thú thử
MIC Minimum Inhibitory
Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu
MBC Minimum Bactericidal
Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
1.5.3. Hệ thống dữ liệu sinh học quốc tế trong khoa học nghiên cứu QSAR QSAR
Lƣợng dữ liệu hóa sinh đƣợc tạo ra bởi các nhà khoa học thực nghiệm ngày càng tăng nhanh với các cơ sở dữ liệu chứa hàng triệu phân tử cùng các hoạt tính sinh học tƣơng ứng. Việc truy cập, khai thác và sử dụng hiệu quả bộ dữ liệu khổng lồ này là một bƣớc quan trọng trong nghiên cứu QSAR nói riêng
và trong khoa học hiện đại nói chung. Hiện nay, trên thế giới xuất bản khoảng 80 đầu tạp chí về độc tính của các hợp chất hóa học [110], tiêu biểu nhƣ: “Toxicology”, “The Journal of Toxicological Sciences”, “SAR and QSAR in Environmental Research”, “Chemical Abstracts”, “Pollution Abstracts”, “Environment Abstracts”, “Ecologycal Abstracts”, “BiologicalAbstracts”, “Index Medicus”, “Environmental Periodicals Bibliography”, “Carrent Contents”... Để đảm bảo tính xác thực, các nguồn dữ liệu về độc tính sinh hóa đƣợc thu thập và kiểm tra, đánh giá thông qua các tổ chức bảo vệ sức khỏe và môi trƣờng nhƣ: WHO (Tổ chức Y tế Thế giới), US EPA (Cơ quan bảo vệ môi trƣờng Hoa Kỳ), ATSDR (Cơ quan quản lý chất độc và đăng ký dịch bệnh); kết hợp với các chƣơng trình về an tồn hóa chất nhƣ: UNЕР (Chƣơng trình liên hiệp các dân tộc vì mơi trƣờng xung quanh), IPCS (Chƣơng trình quốc tế về an tồn hóa chất). Theo đó, các dữ liệu sau khi đƣợc kiểm tra sẽ đƣợc xuất bản dƣới các dạng tài liệu và tạp chí ấn lốt.
Hiện nay, các nguồn dữ liệu sinh học đƣợc tích hợp và quản lý bằng các hệ thống điện tử. Theo đó, nguồn dữ liệu đƣợc phổ biến đến cộng đồng nghiên cứu trên tồn cầu thơng qua các trang mạng điện tử. Một số nguồn cơ sở dữ liệu về độc tính sinh học của các phân tử đƣợc cho trong Phụ lục 1. Các phân tích chi tiết hơn các nguồn dữ liệu điện tử về độc tính đƣợc trình bày trong các nghiên cứu [25, 95, 113, 114].
1.5.4. Tình hình nghiên cứu QSAR về BPA và các dẫn xuất ở trong và ngoài nước ngoài nước
Nhận thức đƣợc tầm quan trọng trong việc nghiên cứu độc tính của BPA, ngay từ những năm 90 của thế kỷ XX một số nghiên cứu liên quan đến độc tính BPA tồn dƣ trong các sản phẩm nhựa đã đƣợc công bố. Những nghiên cứu trong giai đoạn này chủ yếu là nghiên cứu thực nghiệm với mục tiêu là khẳng định tính có hại của BPA cũng nhƣ xác định liều lƣợng tiếp xúc an toàn
cho ngƣời và các sinh vật. Bƣớc sang những năm cuối của thế kỷ XX và những năm đầu của thế kỷ XXI với sự phát triển bùng nổ của công nghệ tin học và sự ra đời của các cỗ máy tính tốn, rất nhiều các nghiên cứu lý thuyết về độc tính của BPA và các dẫn xuất đã đƣợc tiến hành. Từ một bộ chất với các dữ liệu sinh học thực nghiệm đã biết, các nghiên cứu tập trung “đặc trƣng hóa” phân tử bởi một hoặc một vài nhóm thơng số, từ đó mơ hình hóa mối quan hệ định lƣợng giữa độc tính và các thông số đặc trƣng của phân tử. Do đó, bài tốn quan trọng trong nghiên cứu QSAR hiện đại là xây dựng đƣợc bộ thông số vừa có khả năng mơ tả sự phân bố 3D của các nguyên tử đồng thời cũng đánh giá đƣợc sự tƣơng tác của trƣờng phân tử lên tính chất điện của mỗi nguyên tử. Các thông số này gọi là thông số cấu trúc 4D, đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp phân tích trƣờng phân tử tổng hợp (Сomparative Molecular Field Analysis - CoMFA) và phƣơng pháp tự tổ chức phân tích trƣờng phân tử (self-organizing molecular field analysis - SOMFA). Năm 2003 trong cơng trình [60] nhóm nghiên cứu Kelly P. Coleman và các cộng sự thuộc trƣờng Đại học Minnesota, Hoa Kỳ đã sử dụng các tƣơng tác van der Waals, tƣơng tác tĩnh điện, tƣơng tác Hydro …làm tham số đặc trƣng kết hợp với phƣơng pháp bình phƣơng cực tiểu từng phần (PLS) để xây dựng mơ hình QSAR. Các mơ hình QSAR thu đƣợc có khả năng tái lập dữ liệu tốt với hệ số xác định R2 ≥ 0,77. Tuy nhiên tính khái qt mơ hình chỉ ở mức trung bình (Q2≤0,607). Ngun nhân có thể vì nhóm tác giả này trong q trình xây dựng mơ hình QSAR đã sử dụng phƣơng pháp PLS - là phƣơng pháp xử lý số liệu tƣơng đối “thơ” dẫn đến mơ hình thu đƣợc có tính khái qt hóa và khả năng dự đốn khơng cao.
Việc tính tốn các tham số CoMFA và SOMFA nhìn chung rất phức tạp và tốn thời gian. Cho nên, nhiều nghiên cứu QSAR đã tập trung tối ƣu hoá bộ thông số 2D và nâng cao chất lƣợng của các phƣơng pháp QSAR 2D hiện có. Theo hƣớng phát triển đó vào năm 2006 nhóm tác giả Cui Shihai, Liu Shushen,
Yang Jing, Wang Xiaodong, Wang Liansheng (Trung Quốc) công bố kết quả nghiên cứu QSAR của chính bộ chất này sử dụng thơng số topo cải biến là các vector khoảng cách - độ âm điện phân tử (Molecular electronegativity distance vector - MEDV) [26]. Bản chất MEDV là các thông số đa giá trị dùng mô tả cấu trúc phân tử các hợp chất hữu cơ dƣới dạng thơng số hình học topo đã đƣợc bổ sung thêm các yếu tố mô tả sự tƣơng tác điện tích giữa các nguyên tử trong phân tử 3D. Theo đó trạng thái nội tại của một nguyên tử trong phân tử đƣợc xác định nhƣ sau:
2
/ 4 ((2 / n) 1) /
I
Trong đó là số electron hóa trị; n là số lƣợng tử chính của lớp vỏ hóa trị của nguyên tử đó; δ và δ là giá trị delta của các liên kết phân tử, đƣợc xác định bằng biểu thức: δ = ζ - h; δ = ζ + π- h; ζ và π là số electron tƣơng ứng ở các obitan ζ và π, h là số liên kết của nguyên tử đó với nguyên tử hydro;
Trạng thái topo điện tử (Electrotopological State) đƣợc số hóa thơng qua chỉ số trạng thái topo điện tử (Electrotopological State (E-State) Index). Chỉ số topo điện tử của nguyên tử i ký hiệu là qi đƣợc xác định bởi công thức:
2 ( ) / all j i i i j ij j i q I I I d ;
Trong đó dij là khoảng cách đồ thị ngắn nhất (graph distance) trong số các đƣờng đi từ nguyên tử i đến nguyên tử j.
Trên cơ sở 3 phƣơng trình nêu trên thơng số vector khoảng cách - độ âm điện phân tử (MEDV) đƣợc xác định: 2
, i j r kl i k j l ij q q x M d ;
Trong đó: k, l = 1, 2, 3, …, 13; l ≥ k tƣơng ứng với 13 kiểu (trạng thái) của một nguyên tử, đặc trƣng bởi số lƣợng các nguyên tử phi hydro liên kết với nguyên tử đó cộng với số xác định ID (identifying number) của nguyên tử. Số xác định ID đƣợc xác định thơng qua số electron hóa trị : ID = ( -4)*4;
r = 1, 2, 3, …, 91 tƣơng ứng với số thứ tự các thông số MEDV trong mỗi phân tử hữu cơ;
i, j là số thứ tự nguyên tử trong phân tử;
Sau khi tính tốn đƣợc 91 thơng số MEDV đặc trƣng cho các phân tử trong bộ chất nghiên cứu, nhóm tác giả này sử dụng phƣơng pháp hồi quy đa biến tuyến tính (MLR) thơng qua chƣơng trình VSMP program để xây dựng mơ hình QSAR với trình tự tiến hành: 1) Hồi quy chọn mơ hình (xác định bộ thơng số tốt nhất để mơ tả phân tử); 2) Xây dựng mơ hình QSAR. Các mơ hình ƣớc tính (Estimated) và dự đốn (Predicted) mà nhóm nghiên cứu này thu đƣợc có các chỉ số thống kê tốt (Hệ số xác định R2 ≥ 0,9; hệ số khái quát Q2 ≥ 0,8). Tuy nhiên, do đặc điểm của thông số MEDV các mơ hình QSAR xây dựng đƣợc về cơ bản chƣa đánh giá đƣợc chính xác ảnh hƣởng của các “mảnh phân tử” lên độc tính Estrogen của phân tử, dẫn đến kết luận của cơng trình này cịn khá chung chung khi khẳng định rằng độc tính estrogen của các phân tử có thể bị ảnh hƣởng bởi nhóm alkyl và nhóm hydroxyl. Để làm tốt việc định hƣớng thiết kế các hợp chất mới trên cơ sở một chất gốc có khả năng đáp ứng tốt các hoạt tính sinh học nhất định, việc xác định các mảnh phân tử ảnh hƣởng trực tiếp đến độc tính, hoạt tính là hết sức cần thiết.
Nghiên cứu QSAR về BPA và các dẫn xuất còn đƣợc cơng bố trong cơng trình [116]. Dựa trên đối tƣợng nghiên cứu là khả năng ức chế hoạt tính androgen nhóm tác giả này đã xây dựng mơ hình QSAR sử dụng phƣơng pháp hồi quy đa biến tuyến tính với sự tham gia của ba biến độc lập là số nhóm hydroxyl (nROH), thế năng cực đại bề mặt phân tử (Vs,max) và mức năng lƣợng electron ở Orbital phân tử còn trống thấp nhất (ELUMO). Mơ hình thu
đƣợc có khả năng dự đốn ở mức độ trung bình với R2
pred = 0,625; ngồi ra các
Ở Việt Nam hiện nay, có một số nhóm các nhà khoa học có hoạt động chun mơn về Hóa tính tốn. Các nhóm nghiên cứu chủ yếu sử dụng lý thuyết hóa lƣợng tử và các phần mềm hóa tin có sẵn nhƣ Gaussian, HyperChem để tính tốn các thơng số cấu trúc, năng lƣợng các phân tử nhằm giải thích cơ chế phản ứng và hình thành các chất mới. Một số cơng trình tiêu biểu nhƣ: khảo sát phản ứng NO + NH2 bằng phƣơng pháp tính DFT.B3LYP; khảo sát cấu trúc của phức Nb(V) với 4-(2-Pyriddylazo)-rezocsin sử dụng phƣơng thức ZINDO/1 chạy trên bộ phần mềm HyperChem…Các nghiên cứu về QSAR về cơ bản chƣa nhiều, chủ yếu tập trung vào một số vấn đề nhƣ: nghiên cứu tƣơng quan giữa cấu trúc điện tử và khả năng ức chế ăn mòn; khảo sát sự liên hệ định lƣợng cấu trúc - hoạt tính của các nhân Azole chống nấm; nghiên cứu sự liên hệ định lƣợng cấu trúc - hoạt tính chống sốt rét của Mefloquyne... Các nhóm khác thực hiện đều theo các phần mềm có sẵn nghiên cứu về khả năng phản ứng, cấu trúc vật liệu, động học của phản ứng. Sự kết hợp giữa tính tốn lí thuyết và thực nghiệm chƣa phổ biến. Các nghiên cứu về quan hệ định lƣợng cấu trúc hóa học và hoạt tính của Bisphenol - A là chƣa có. Đây là nghiên cứu đầu tiên về vấn đề này. Các tài liệu bằng tiếng Việt chỉ là các thông tin trên các trang điện tử dạng tin đƣợc trích xuất từ các phƣơng tiện thông tin đại chúng của thế giới.
Trên cơ sở phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu QSAR của BPA trong và ngồi nước, có thể rút ra một số kết luận sau:
(1) BPA và các dẫn xuất là các tiền chất có ý nghĩa quan trọng trong công nghiệp và đời sống. Phạm vi ứng dụng của nó rất rộng nhƣng nguy cơ gây hại tiềm ẩn rất lớn, đòi hỏi phải nghiên cứu và làm rõ. QSAR hiện đang là cơng cụ hết sức hữu ích cho việc này.
(2) Việc lựa chọn và tính tốn các thơng số mới về cấu trúc, kết hợp với phƣơng pháp xử lý số liệu có khả năng mơ tả đúng mối quan hệ phức tạp của các thơng số cấu trúc và hoạt tính là điều rất cần thiết, trong đó các thơng
số cấu trúc electron cùng với phƣơng pháp thống kê toán học cổ điển là hồi quy và phƣơng pháp mạng neural nhân tạo đƣợc sử dụng rộng rãi và cho kết quả phù hợp với giá trị thực nghiệm hơn cả.
(3) Trong các chƣơng trình có thể thiết kế cấu trúc không gian của phân tử đồng thời kết hợp với phƣơng trình hố lƣợng tử để tối ƣu hố hình dạng của phân tử thì phần mềm Gaussian thƣờng đƣợc sử dụng và trong nhiều trƣờng hợp cho kết quả rất thuyết phục.
(4) Trong luận án này, mơ hình QSAR bằng các phƣơng pháp toán học kinh điển (phƣơng pháp MLR và ANN) trên cơ sở hoạt tính estrogen đã đƣợc nghiên cứu bằng thực nghiệm và các thông số cấu trúc, năng lƣợng tính tốn đƣợc bằng các phần mềm Gaussian 09 và Gausview06.
Chƣơng II
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu và các phân tích sinh học
Bộ dữ liệu đƣợc sử dụng trong luận án này gồm BPA và 22 hợp chất là dẫn xuất của BPA đƣợc tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính sinh học bởi nhóm nghiên cứu của trƣờng Đại học Minnesota và trƣờng Đại học New Orleans, Hoa Kỳ [60]. Dữ liệu hoạt tính sinh hóa của bộ chất này đƣợc kiểm nghiệm và sử dụng trong các công bố [26, 59]. Cấu tạo của các phân tử trong bộ dữ liệu đƣợc trình bày ở Bảng 2.1 và đƣợc minh họa trên Hình 2.1.
Bảng 2.1. Cấu tạo phân tử của bộ chất nghiên cứu [60]
STT Hợp chất Nhóm thế 1 2 3 4 5 6 7 8 9 R1 R2 1 DM DMB Bis A H CH3 OH H H H CH3 OH H CH3 CH2CH(CH3)2 2 DMB Bis A H H OH H H H H OH H CH3 CH2CH(CH3)2 3 MM4 H H OH H H H H OH H C2H5 C2H5 4 Bis A H H OH H H H H OH H CH3 CH3 5 HF Bis A H H OH H H H H OH H CF3 CF3 6 DM HPTE H CH3 OH H H H CH3 OH H H CCl3 7 MM1 H H OH H H H H OH H H CH3 8 Bis F H H OH H H H H OH H H H 9 Bis B H H OH H H H H OH H CH3 C2H5 10 DM Bis A H CH3 OH H H H H OH CH3 CH3 CH3 11 HPTE H H OH H H H H OH H H CCl3 12 1844-00-44 H H OH H H H H OH H H CH(CH3)2 13 MM2 H H OH H H H H OH H H C2H5 14 TM Bis A H CH3 OH CH3 H H CH3 OH CH3 CH3 CH3 15 o,p‟-Bis A H H H H OH H H OH H CH3 CH3 16 Mono Mxy Bis A H H OH H H H H OCH3 H CH3 CH3 17 P Bis A H H OH H H H H OH H CH3 C6H5 18 PCP H H H H H H H OH H CH3 CH3 19 MH MM1 H H OH H H H H H H CH3 H 20 MH Bis F H H H H H H H OH H H H 21 TC Bis A H Cl OH Cl H H Cl OH Cl CH3 CH3 22 TB Bis A H Br OH Br H H Br OH Br CH3 CH3 23 Mxy Bis A H H OCH3 H H H H OCH3 H CH3 CH3
Hình 2.1. Minh họa cấu trúc phân tử của các chất trong bộ dữ liệu khảo sát [60]
Hoạt tính sinh học đƣợc chọn lựa cho nghiên cứu này là mức độ hoạt động estrogen đƣợc đánh giá dƣới dạng biểu hiện sinh học của các gen tín hiệu (reporter gene) đƣợc gắn vào trong tế bào. Theo đó, thơng số hoạt tính đƣợc chọn là EC50 (half maximal effective concentration), đƣợc đo bằng đơn vị mol/L (M), là nồng độ gây 50% hiệu ứng sinh học tối đa, trong thời gian phơi nhiễm thực nghiệm là 72 giờ.
Các giá trị hoạt tính sinh học thu đƣợc bằng phép phân tích sinh hóa thực nghiệm in vitro đối với các tế bào MVLN - là dịng tế bào có nguồn gốc từ các tế bào ung thƣ vú MCF-7 ở ngƣời và thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ hữu hiệu để sàng lọc các hợp chất theo mức độ hoạt động estrogen. Theo đó, các gen luciferase đƣợc gắn vào (lan truyền vào) trong các tế bào MVLN và đóng vai trị là các gen tín hiệu (reporter gene) bằng cách xúc tác