đốn cúm cơ bản trong phịng thí nghiệm thì ngày càng có nhiều các kỹ thuật chẩn
đốn mới, nhanh, hiện đại đáp ứng được nhu cầu xác định sớm sự nhiễm virút cúm để có các biện pháp cách ly, điều trị kịp thời tránh lây nhiễm cho người tiếp xúc
cũng như trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về nhân lực cũng như về kinh tế do cúm gây ra. Việc phân tích các mẫu bệnh phẩm sinh học này sẽ là một khâu then chốt để hiểu được đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh này, kể cả về những khía cạnh kháng thể sau khi lây nhiễm, q trình khu trú và phát tán virút trong các dịch khác nhau của cơ thể.
1.7.1. Phương pháp phát hiện kháng nguyên
1.7.1.1. Thử nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest)
Đây là một thử nghiệm miễn dịch phát hiện kháng nguyên của virút cúm, kháng thể đơn dịng có trong que thử kết hợp với kháng nguyên nucleoprotein (NP) của virút cúm.
Ưu điểm của thử nghiệm này là nhanh (cho kết quả trong vòng 15-20 phút), đơn giản, là một thử nghiệm khách quan có thể áp dụng cho bệnh phẩm lâm sàng hoặc hỗn dịch nuôi cấy virút. Tuy nhiên, nhược điểm của thử nghiệm này độ nhạy và độ đặc hiệu kém, một số bộ sinh phẩm không phân biệt được typ huyết thanh A hoặc B, không xác định được phân typ (H1, H3, H5...), giá thành cao (từ 12 USD – 25 USD/ 1 thử nghiệm). Theo tổng kết nghiên cứu của một số tác giả cho thấy độ nhạy trung bình 70 -75%, độ đặc hiệu trung bình 90- 99%; độ nhạy khi phát hiện virút cúm A cao hơn virút cúm B [21, 22].
Thử nghiệm này rất có hiệu quả trong sàng lọc và điều tra dịch cúm mùa ở người (cúm A/H1, H3, B...) nhưng khơng có giá trị trong việc phát hiện cúm A/H5N1 .
Hiện nay, trên thế giới có 10 bộ sinh phẩm chẩn đốn nhanh cúm trong đó 8 bộ do Mỹ và 2 bộ do Nhật Bản sản xuất bao gồm:
- Bộ sinh phẩm chỉ phát hiện cúm A: 1 bộ
- Bộ sinh phẩm phát hiện và phân biệt cúm A và B: 6 bộ
Directigen Flu A + B.
FLU OIA A/B.
XPECT FLU A/B.
NOW FLU A/B.
Capilia Flu A/B.
Influ A/B Quick.
- Bộ sinh phẩm phát hiện nhưng không phân biệt cúm A và B: 3 bộ
QuickVue Influenza Test.
FLU OIA.
ZstatFlu.
1.7.1.2. Phân lập và định týp virút
Yêu cầu về an toàn sinh học
Đối virút cúm mùa (cúm A/H3N2, A/H1N1, B...): việc phân lập virút phải được tiến hành trong phịng thí nghiệm an toàn cấp độ 2.
Đối với virút cúm gia cầm (cúm A/H5N1, H9N2...): là virút nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virút phải được tiến hành trong phịng thí nghiệm an tồn sinh học cấp độ 3.
Phân lập virút được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [22]. Chủng virút phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính chất kháng ngun để có thể dự báo được sự lan truyền của một chủng virút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho sự lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm.
Hiện nay, có 2 hệ thống phân lập được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dịng tế bào thường trực thận chó ( Mardin- Darby canine kidney cells - MDCK).
* Phân lập virút trên trứng: Virút cúm được phân lập đầu tiên trên trứng gà
năm 1936. Sau khi cấy virút vào khoang niệu hoặc khoang ối, trứng được ủ ở 330
trong vòng 48h. Dịch niệu hoặc dịch ối thu được sau khi gặt trứng được kiểm tra hiệu giá bằng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu ngựa 1% [22]. Một số virút cúm A có thể phân lập trực tiếp bằng việc gây nhiễm vào khoang niệu nhưng cũng những chủng virút cúm A phải gây nhiễm trên dịch ối sau đó mới thích ứng lên khoang niệu trứng gà. Virút cúm A/H5N1 thường gây chết trứng sau 24h hoặc 48h gây nhiễm bệnh phẩm.
* Phân lập trên tế bào cảm thụ MDCK: Virút cúm có thể nhân lên trên các
dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như MDCK, Vero. MDCK là dịng tế bào thích hợp nhất để phân lập virút cúm trên người. Khi phân lập virút trên các dòng tế bào thường trực phải bổ sung trypsin (TPCK) – protease ngoại sinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trypsin TPCK có ảnh hưởng tới sự phân tách phân tử HA thành HA1 và HA2, đóng vai trị quan trọng trong việc xâm nhập của virút vào tế bào cảm thụ. Tuy nhiên, đối với các dịng tế bào tiên phát thì protease là yếu tố nội sinh, vì vậy virút cúm vẫn có khả năng nhân lên mà khơng cần phải bổ sung trypsin trong q trình ni cấy [88]. Ưu điểm của việc phân lập virút cúm trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, có khả năng phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, tuỳ theo mục đích nghiên cứu để lựa chọn phương pháp phân lập. Phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thế giới vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virút với hiệu giá cao [43, 89]. Tuy nhiên, việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu [16, 63].
* Định týp virút: virút sau khi phân lập được định týp ( xác định đặc tính
kháng nguyên ) bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI).
1.7.1.3. Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescent assay - IFA)
Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật có hiệu quả trong chẩn đoán cúm. Tế bào cảm thụ sau khi gây nhiễm bệnh phẩm hoặc các tế bào biểu mô đường hô hấp trong bệnh phẩm lâm sàng (kháng nguyên) sẽ được rửa và cố định trên phiến kính. Kháng nguyên sau khi được cố định sẽ được gắn với các kháng thể đơn dòng
đặc hiệu týp và phân týp. Sau đó, kháng thể đơn dịng được phát hiện bằng kháng thể kháng IgG chuột gắn huỳnh quang FITC.
Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật nhanh và nhạy, được sử dụng thường xuyên trong các phịng thí nghiệm chẩn đốn vi sinh vật học. Nhưng kỹ thuật này địi hỏi phải có chun gia trong việc thực hiện và đọc kết quả. Mặt khác, thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang đòi hỏi phải sử dụng tế bào đã được gây nhiễm virrút cúm hoặc trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng, đặc biệt với virút cúm A/H5N1, nên các bước tiến hành thử nghiệm phải được tiến hành trong phịng thí nghiệm an tồn sinh học bậc 3.
1.7.2. Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền
1.7.2.1. Phương pháp RT-PCR
Phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction) đã được áp dụng và phát triển cho phần lớn các virút có vật liệu di truyền là ARN. Phương pháp này có khả năng xác định nhanh sự nhiễm virút thông qua xác định vật liệu di truyền của virút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của virút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Đây là phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác khi được kiểm sốt tốt.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những hạn chế nhất định trong việc chẩn đoán sớm các trường hợp mắc bệnh do việc lựa chọn loại mẫu bệnh phẩm cũng như thời gian phù hợp để lấy mẫu. Phương pháp RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao, khả năng dễ bị tạp nhiễm bởi tác nhân ngoại lai.
Cho tới nay, RT-PCR vẫn được coi là phương pháp tối ưu để phát hiện virút cúm, là một trong hai tiêu chuẩn trong chẩn đốn phịng thí nghiệm để khẳng định các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 theo qui định của TCYTTG.
1.7.2.2. Phương pháp Real time RT-PCR
Phương pháp Real time RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular
beacon, hybridization probe và Taqman probe) cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của virút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [41, 57, 65]. Phương pháp Real time RT-PCR được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán các virút gây bệnh như virút cúm A/H5N1, RSV… [33, 35].
Phương pháp Real time RT-PCR không cần điện di sản phẩm như phương pháp RT-PCR thông thường nên phương pháp Real time RT-PCR được mô tả như một hệ thống “đóng”. Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, nhạy, có độ chính xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm [55]. Tuy nhiên, phương pháp Real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao.
1.7.2.3. Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã
ngược (RT-LAMP)
Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược RT-LAMP (Reverse transcriptase – Loop - mediated isothermal amplification) là một phương pháp mới để khuếch đại ADN trong điều kiện đẳng nhiệt, do đó loại bỏ được sự thay đổi các chu kỳ nhiệt trong phương pháp RT-PCR thông thường. Phản ứng khuếch đại ADN thực hiện tại 630C trong 60 phút và cố định sản phẩm tại 800
C trong 2 phút trong hệ thống máy Loopamp-real time LA-200 (Kyoto – Nhật Bản). Vì vậy, thời gian tiến hành phản ứng sẽ được rút ngắn [79, 85]. Trong một phản ứng đã sử dụng 6 loại mồi bao gồm 2 mồi trong, 2 mồi ngoài và 2 mồi dạng vòng đã làm tăng độ nhạy của phản ứng. Phương pháp này có thể phát hiện virút cúm trong giai đoạn sớm của bệnh [74]. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này cần được đánh giá thông qua một số lượng lớn mẫu thu thập ở bệnh nhân nhiễm cúm. Hiện nay, phương pháp này cũng đang được phát triển để chẩn đoán nhanh một số bệnh truyền nhiễm khác do virút như virút SARS-CoV, virút viêm gan B,
virút viêm não Nhật Bản [122].
1.7.2.4. Phương pháp xác định trình tự gen
phân tích trình tự chuỗi tự động như ABI PRISM 3100 - Avant, BechmanCounter (Mỹ). Nguyên tắc của phản ứng dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có sử dụng các dideoxynucleotide. Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một chất huỳnh quang có màu khác nhau.
Sự xuất hiện của các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ dài khác nhau. Những đoạn ADN này được điện di qua mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser.
Phương pháp xác định trình tự gen xác định đặc điểm di truyền học, xây dựng cây gia hệ trên cơ sở so sánh gen HA, NA và M của virút cúm, từ đó xác định tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của virút, giảm độ nhạy của thuốc kháng virút cũng như phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của virút cúm A/H5N1 và các chủng virút cúm đang lưu hành.
ADN sợi đơn
Thành phần: DNA polymerase I dATP dGTP dCTP dTTP
Trong qua trình điện di, đầu đọc laser sẽ thu được tín hiệu của các ddNTP Đoạn ADN lớn Đoạn ADN nhỏ Trình tự của mẫu ban đầu sẽ là ddATP ddGTP ddCTP ddTTP
1.7.3. Phương pháp phát hiện kháng thể
Đó là phương pháp phát hiện kháng thể kháng virút cúm trong huyết thanh bệnh nhân. Có 3 phương pháp cơ bản được sử dụng là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) và phản ứng trung hoà vi lượng (MN). Kết quả được xác định dựa vào việc phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu virút cúm (ELISA, MN) hoặc sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HI). Chẩn đốn huyết thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu và có tác dụng rất hạn chế đối với các trường hợp lâm sàng. Tuy nhiên, nó cũng là cơ sở cho việc chẩn đoán nếu như việc phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của virút không đạt kết quả do chất lượng bệnh phẩm hoặc một lý do nào khác.
1.7.3.1. Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition
test - HI)
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) được Hirst GK phát hiện năm 1942 [56]. Nguyên lý của phản ứng là kháng thể (KT) kháng HA đặc hiệu virút cúm (antiheamagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1, A/H3, A/H5, B…) có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu. Hồng cầu chuột lang 0,75% hoặc hồng cầu gà 0,5% được sử dụng trong phản ứng HI để phát hiện KT kháng virút cúm mùa, hồng cầu ngựa 1% được sử dụng để phát hiện KT kháng virút cúm A/H5N1 [21, 22].
Phản ứng HI tương đối đơn giản, kinh tế, có thể áp dụng để phát hiện sự lưu hành của KT kháng đặc hiệu virut cúm với một số lượng mẫu lớn. Phần lớn kháng thể kháng HA đều được phát hiện bằng phản ứng HI, vì vậy đây là phản ứng đặc hiệu phân týp đối với chẩn đoán huyết thanh học cúm. Tuy nhiên, phản ứng HI chỉ có giá trị trong chẩn đốn cúm khi có mẫu huyết thanh kép để xác định được sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh. Mẫu huyết thanh đơn khơng có giá trị trong chẩn đoán. Mặt khác, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ nhạy thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lượng [123].
1.7.3.2. Phản ứng trung hoà vi lượng (Microneutralization test - MN).
Phản ứng trung hòa vi lượng – ELISA được Hormon và cs phát triển năm 1988 [47]. Nguyên lý của phản ứng là sử dụng kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu nucleoprotein (NP) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên NP trong tế bào nhiễm virút cúm. Sử dụng phương pháp Reed & Muench để tính giá trị liều gây nhiễm 50% trên tế bào (TCID50) [96].
Phản ứng trung hòa vi lượng là một phản ứng nhạy và đặc hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu virút cúm A/H5N1 và kháng thể kháng các phân týp virút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI khơng có khả năng phát hiện được [123]. Phản ứng này dễ tiến hành vì khơng cần kháng ngun tinh khiết. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian tiến hành thí nghiệm kéo dài ( 2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với virút sống, đặc biệt là virút cúm A/H5N1, nên thí nghiệm phải tiến hành trong phịng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3.
1.7.3.3. Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme linked –
immusorbent assay - ELISA)
Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) được Murphy và cs phát triển năm 1980 để đánh giá đáp ứng kháng thể của những người tình nguyện tiêm vắc xin cúm A [77]. Đây là thử nghiệm được sử dụng để phát hiện kháng thể IgG và IgM kháng virút cúm. Kháng thể có trong huyết thanh bệnh nhân sau khi gắn với kháng nguyên đã gắn trên giá rắn sẽ được phát hiện bằng kháng thể khác. Ở phương pháp trực tiếp, kháng thể phát hiện được cộng hợp trực tiếp với enzyme. Còn trong phương pháp gián tiếp, kháng thể không được đánh dấu mà được phát hiện bằng kháng thể kháng IgG và IgM đặc hiệu loài cộng hợp với enzyme.
Thử nghiệm ELISA được sử dụng rộng rãi để phát hiện kháng thể IgG và IgM kháng virút cúm [73, 77, 123]. Kháng nguyên sử dụng cho thử nghiệm này đã được xử lý, bất hoạt nên đảm bảo độ an toàn sinh học cao.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Định nghĩa ca bệnh
* Bệnh nhân hội chứng cúm
- Sốt cao trên 38oC.
- Đau đầu, đau mỏi người, ho khan, có thể kèm theo viêm long đường hô hấp.
* Bệnh nhân viêm phổi nặng nghi nhiễm virút cúm A/H5N1
- Sốt cao trên 380C.