Cây Địa điểm Tỷ lệ xâm nhiễm nấm của Mycorhiza trong rễ (%) / Hàm lượng Cd, Pb tương ứng trong đất (ppm)
Kèo nèo Bình Chánh 17.8/ (0.94;42.19) 21.9/ (1.55;48.21) 25.8/ (1.96;65.03) 31.3/ (2.79;89.73) Ơ rơ Dĩ An, B. Dương 42.7/ (0.32;16.98) 49.1/ (0.47;37.16) 51.8/ (1.31;58.22) 68.2/ (1.95;87.31) Bạc hà (Dọc mùng) Thuận An, B.Dương 36.2/ (0.29;8.55) 44.9/ (0.45;16.49) 53.3/ (0.96;11.47) 57.4/ (1.37;60.54) Đậu rồng Đồng Nai Biên Hòa 44.9/
(0.44;23.35) 49.5/ (0.62;44.78) 54.1/ (1.0;60.79) 59.3/ (1.86;77.55) Đậu bắp Đồng Nai N.Trạch, 47.2/ (0.36;20.0) 53.4/ (0.49;34.7) 66.2/ (1.15;50.12) 71.7/ (1.76;70.86) Thực vật cung cấp cho nấm cộng sinh Mycorhiza nguồn các bon chất hữu cơ, giúp cho VSV thực hiện các hoạt động trao đổi chất cũng như sự chuyển hóa năng lượng. Nấm cộng sinh Mycorhiza ngoài việc cung cấp dinh dưỡng cho cây cịn làm giảm, khử tính độc của KLN. Vì vậy khi hàm lượng cao của KLN trong đất gây bất lợi cho thực vật, nhờ mối quan hệ cộng sinh, quần thể Mycorhiza phát triển mạnh hơn về số lượng để góp phần hạn chế tính độc của KLN đối với thực vật ký chủ.
Tỷ lệ xâm nhiễm của nấm cộng sinh Mycorrhiza: Nhờ tác dụng kích thích của dòng các bon từ rễ cây tiết ra, các bào tử nấm Mycorhiza trong đất nãy mầm và xâm nhiễm vào rễ cây ký chủ, hình thành cấu trúc dạng bọng (“Vesicules”, gọi là thể V) hoặc những cấu trúc dạng bụi, chùm (“Arbuscular”, gọi là thể A) bên trong tế bào rễ cây (Brundrett Mark, 2004) [53].
Số liệu ở bảng 3.15 cho thấy khi tăng hàm lượng Cd và Pb trong đất thì tăng tỷ lệ xâm nhiễm cũng tăng với nhữg mức độ khác nhau giưuã các loài thực vật được khảo sát. Tỷ lệ xâm nhiễm của nấm cộng sinh Mycorrhiza ở cây Ơ rơ là 84,6% khi đất có 2,79 ppm Cd; 112,69 ppm Pb, và giảm xuống 581,8% ở đất có hàm lượng 1,31 ppm Cd, 58,22 ppm Pb và hệ số xâm nhiễm nấm Mycorrhiza chỉ đạt 42,7% khi trong đất có hàm lượng tương ứng 0.33 ppm Cd và 16,98 ppm Pb. Xu hướng thay đổi tương tự với số lượng bào tử, tỷ lệ xâm nhiễm của nấm Mycorrhiza vào rễ các cây Kèo nèo, Dọc mùng, Đậu rồng, Đậu bắp.
Các sợi nấm của Mycorrhiza tạo nên sự tiếp xúc và lan rộng khắp tròng đất, cho phép chưa một lượng lớn KLN trong sợi nấm. Khi đó nấm Mycorrhiza gắn các KLN vào các thành phần của thành tế bào thực vật ký chủ, như Chinin, Xellulo, và metanin hoặc bên trong tế bào nơi có hàm lượng N-, S- cao bằng các liên kết peptit tương tự như metallothionein. Nhờ vậy hạn chế tối đa sự xâm nhập của KLN vào trong hệ thống xilem, protein, gián tiếp giảm độc tính của KLN đối với cây ký chủ. Có ít nhất là 2 hợp chất trong nấm Mycorrhiza sống cộng sinh đóng vai trị chính trong q trình ngăn cản các KLN như cacdimi, chì xâm nhập vào tế bào thực vật ký chủ là polyphosphate và glomalin [75].
3.3.3. Phân lập VSV và xác định khả năng tích lũy, chuyển hóa As, Cd, Pb, Hg
Lựa chọn 70 mẫu (50 mẫu đất, 20 mẫu bùn) có hàm lượng KLN cao, tiến hành làm giàu và phân lập trên môi trường chuyên biệt đã phân lập được các chủng VSV thuộc cả 3 nhóm: vi khuẩn, nấm mốc và nấm cộng sinh vùng rễ có khả năng chống chịu với hàm lượng KLN cao (Phụ lục 11). Sau khi phân lập đã tiến hành đánh giá khả năng chống chịu với KLN trong môi trường (kiểm tra nhanh khả năng kháng As, Cd, Pb, Hg theo phương pháp thạch đĩa của Munger, 2002) ở nồng độ tương đương nồng độ ô nhiễm KLN trong đất ở ngưỡng cảnh báo) và hiệu quả đa chống chịu (chống chịu đồng thời với 4 loại KLN thử nghiệm), kết quả chỉ còn 10 chủng VSV. Trong đó có 4 chủng vi khuẩn (ĐHCM5-VK2, ĐHCM23-VK4, ĐTG11-VK5, BHCM7-VK2), 3 chủng vi nấm (ĐHCM26-VN5, ĐCT4-VN2, BHCM15-VN1) và 3 chủng nấm rễ cộng sinh mycorrhiza (ĐHCM20-AMF4, ĐCT15-AMF4, BHCM3- MF3) có khả năng tích lũy và chuyển hóa KLN.
Đánh giá tổng hợp khả năng chống chịu của 10 chủng VSV với cả 4 KLN được xác định khả năng tích lũy (Cd, Pb) hoặc chuyển hóa (As, Hg) ở 4 mức (4 nồng độ khác nhau) trong điều kiện phịng thí nghiệm. Kết quả cho thấy có 3 chủng: BHCM7- VK2; BHCM15-VN1; ĐHCM20-AMF4 đạt các tiêu chuẩn tuyển chọn đặt ra (khả năng kháng: >10 mg As2+, Hg2+, Cd2+, Pb2+/l đối với các chủng vi khuẩn, nấm men, nấm mốc và nấm rễ. Khả năng tích lũy Cd2+> 20 mg/g sinh khối sau 72 giờ nuôi cấy; Pb2+> 50 mg/g sinh khối sau 72 giờ ni cấy. Khả năng chuyển hóa: >50% Hg2+, As2+ biến đổi sang dạng khí sau 96 giờ nuôi cấy.
Kết quả định danh vi sinh vật
Sau khi thu thập, xử lý kết quả giải trình tự ADN của các chủng VSV nghiên cứu. Các kết quả này được đối chiếu với cơ sở dữ liệu trên ngân hàng gen NCBI (National Center for Biotechnology Information) bằng phần mềm NCBI BLAST. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.16.
Bảng 3.16. Kết quả so sánh trình tự ADN các vi sinh vật nghiên cứu với trình tự ADN
Các chủng VSV trên ngân hàng dữ liệu ADN (The National Center for Biotechnology Information) bằng chương trình NCBI-Standard Nucleotide BLAST
S T T Ký hiệu chủng Độ dài đoạn so sánh Độ tương đồng (%)
Tên lồi gần gũi
Cơng bố liên quan/mã số ngân hàng gen 01 BHCM7-VK2 1468 99,73 Bacillus licheniformis strain DSM 13 NR_118996.1 02 BHCM15-VN1 632 100,0 Penicillium chrysogenum strain WM 06.341 isolate ISHAM-ITS_ID MITS2112 DQ249212.1
03 ĐHCM20AMF4 555 100,0 Glomus intraradices
clone RG3.3
AJ517775.1
Kết quả giải trình tự gen và xác định vị trí phân loại của 03 chủng VSV. Chủng BHCM7-VK2 có trình tự tương đồng với loài vi khuẩn Bacillus licheniformis với mức độ tương đồng 99,73%, chủng BHCM15-VN1 có trình tự tương đồng với lồi nấm mốc Penicillium chrysogenum với mức độ tương đồng 100% và chủng ĐHCM20AMF4 có quan hệ gần với lồi nấm Glomus.
Mức độ an toàn sinh học:
Cả 3 chủng đều có mức an tồn sinh học như sau:
NIH (2016): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; không gây bệnh cho người, động - thực vật).
BMBL (2009): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động - thực vật).
Australia/New Zealand (2010): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
Belgium (2008): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
Canada (2015): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
EU (2000): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
Germany (2013): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
Japan: Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
Singapore: Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
Switzerland: Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
UK (2013): Cấp độ 1 (được phép sử dụng trong nghiên cứu, giảng dạy, thử nghiệm và sản xuất không giới hạn; Không gây bệnh cho người, động vật và thực vật).
3.3.4. Tuyển chọn các chủng VSV có khả năng tích lũy, chuyển hóa Pb, Cd, As, Hg cao ở vùng nghiên cứu Hg cao ở vùng nghiên cứu
Để chọn các chủng VSV có khả năng tích lũy, chuyển hóa As, Cd, Pb, Hg, đánh giá khả năng tích lũy, chuyển hóa KLN của 3 chủng VSV phân lập được là BHCM7-VK2; BHCM15-VN1; ĐHCM20-AMF4 với 2 chủng có sẵn là B.subtilis, Glomus australe là chủng có khả năng tích lũy, chuyển hóa KLN, được sử dụng để
làm đối tượng so sánh trong phịng thí nghiệm và ngồi nhà lưới.
Nồng độ KLN được chọn để thử nghiệm là nồng độ thử nghiệm tối đa (NĐTNTĐ) và nồng độ tối thích (NĐTT). Nồng độ tối thích được xác định trên cơ sở hoặc là khả năng chuyển hóa, tích lũy cao nhất hoặc là nồng độ KLN để cho sinh khối VSV cao nhất. Thơng thường với nhóm VSV chuyển hóa, nồng độ tối thích dễ
xác định hơn nhưng với nhóm tích lũy KLN nồng độ tối thích thường khó xác định và phải dựa vào sinh khối VSV.
Kết quả thử nghiệm về khả năng tích lũy, chuyển hóa KLN của 3 chủng được tuyển chọn và 2 chủng có sẵn trong phịng thí nghiệm (Phụ lục 14) cho thấy:
Khả năng tích lũy Pb của 2 chủng có sẵn thấp hơn 3 chủng tuyển chọn. Trong đó, chủng nấm rễ cộng sinh tuyển chọn có khả năng tích lũy cao gấp 1,5 - 2 lần các chủng còn lại. Ở NĐTT 70 mg/l, chủng nấm rễ cộng sinh ĐHCM20-AMF4 có khả năng tích lũy cao nhất là 19,77 mg, thấp nhất là chủng nấm mốc BHCM15-VN1 3,89 mg. Ở NĐTNTĐ 700 mg/l, chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng tích lũy Pb cao nhất 92,03 mg, thấp nhất là chủng nấm mốc BHCM15-VN1 49,72 mg.
Khả năng tích lũy Cd của các chủng vi khuẩn cao hơn là các chủng vi nấm. Ở NĐTT 2 mg/l, chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng tích lũy cao nhất 1 mg, thấp nhất là chủng nấm rễ cộng sinh ĐHCM20-AMF4 0,12 mg. Ở NĐTNTĐ 20 mg/l chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng tích lũy Cb cao nhất 34,12 mg, thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus austral 14 mg.
Chuyển hóa As ở NĐTT 12mg/l, chủng nấm rễ ĐHCM20-AMF4 có khả năng chuyển hóa cao nhất 86,89 mg, thấp nhất là chủng vi khuẩn B.subtilis 35,09 mg. Ở NĐTNTĐ 100 mg/l, cả 3 chủng tuyển chọn đều chuyển hóa tương đương nhau nhưng chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng chuyển hóa cao nhất (53,06 mg) và thấp nhất là vi khuẩn B.subtilis (21,66 mg).
Chuyển hóa Hg ở NĐTT 0,1 mg/l, cả 3 chủng tuyển chọn đều có khả năng chuyển hóa cao gấp 2 - 3 lần 2 chủng đã có. Trong đó, chủng nấm rễ cộng sinh ĐHCM20-AMF4 có khả năng chuyển hóa cao nhất 92,1 mg, thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus australe 34 mg. Ở NĐTNTĐ 2 mg/l, 3 chủng tuyển chọn có khả năng chuyển hóa gần bằng nhau gấp 2 - 6 lần 2 chủng đã có. Trong đó, cao nhất là chủng nấm rễ cộng sinh ĐHCM20-AMF4 chuyển hóa 57,03 mg và thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus australe 10,53 mg.
Từ kết quả phân tích trên có thể nhận xét như sau: Kết quả thử nghiệm trong phịng thí nghiệm của cả 3 chủng đang tuyển chọn đều có biểu hiện hiệu quả tích lũy Cd, Pb hoặc chuyển hóa As, Hg cao hơn với những chủng đã biết (so sánh BHCM7-
VK2 với B.subtilis; ĐHCM20 - AMF4 với (Glomus australe).
Sau thử nghiệm trong phịng thí nghiệm, tiến hành thử nghiệm khả năng tích lũy, chuyển hóa KLN ngồi nhà lưới. Kết quả Phụ lục 15 cho thấy:
Khả năng tích lũy Pb của 3 chủng tuyển chọn và 2 chủng có sẵn khơng có sự khác biệt lớn. Ở NĐTT 70 mg/l, chủng nấm rễ cộng sinh ĐHCM20-AMF4 tích lũy cao nhất 11,84 mg và chủng nấm mốc BHCM15-VN1 tích lũy thấp nhất 2,52 mg. Ở NĐTNTĐ 700 mg/l, chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng tích lũy Pb cao nhất 62,42 mg và thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus australe 38,88 mg.
Khả năng tích lũy Cd ở NĐTT 2mg/l của các chủng vi khuẩn cao hơn là các chủng vi nấm từ 4 - 7 lần. Chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng tích lũy cao nhất 0,79 mg và thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus australe 0,88 mg. Ở NĐTNTĐ 20 mg/l, chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng tích lũy cao nhất (24,76 mg) và thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus australe (11,27 mg).
Khả năng chuyển hóa As ở NĐTT 12mg/l cao nhất là chủng nấm rễ ĐHCM20- AMF4 60,87 mg, cao gấp 2 lần chủng có khả năng chuyển hóa thấp nhất là chủng vi khuẩn B.subtilis 21,56 mg. Ở NĐTNTĐ 100 mg/l, cả 3 chủng tuyển chọn đều chuyển hóa tương đương nhau và cao gấp 1,5 lần 2 chủng đã có. Tuy nhiên, chủng nấm mốc BHCM15-VN1 chuyển hóa cao nhất (37,42 mg) và thấp nhất là vi khuẩn B. subtilis (14,18 mg).
Chuyển hóa Hg ở NĐTT 0,1mg/l, cả 3 chủng tuyển chọn có khả năng chuyển hóa cao gấp 2 - 3 lần 2 chủng đã có. Trong đó, chủng vi khuẩn BHCM7-VK2 có khả năng chuyển hóa cao nhất 64,31 mg và thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus australe 22,01 mg. Ở NĐTNTĐ 2 mg/l, 3 chủng tuyển chọn có khả năng chuyển hóa gần bằng nhau, gấp 2 - 5 lần 2 chủng đã có. Chủng nấm rễ ĐHCM20-AMF4 chuyển hóa cao nhất 40,01 mg và thấp nhất là chủng nấm rễ Glomus australe 5,79 mg.
Từ các chủng đã tuyển chọn được, tiến hành sản xuất 2 loại chế phẩm VSV có khả năng chuyển hóa, tích lũy KLN cho 2 loại đất thí nghiệm.
Thành phần chế phẩm:
+ Thành phần: Chứa các chủng VSV sau đây: CBHCM7-VK2: Bacillus licheniformis; ĐHCM20AMF4: Glomus intraradices
+ Mật độ: Bacillus licheniformis ≥ 5,00 x 108 CFU/g; Glomus intraradices ≥ 100 IP/g
Sử dụng than bùn (hoặc mụn dừa) là cơ chất
- CP dạng 2: Kết hợp với thực vật để xử lý bùn, nước bị ô nhiễm KLN.
+ Thành phần: Chứa chủng VSV sau đây: BHCM15-VN1: Penicillium chrysogenum
+ Mật độ: Penicillium chrysogenum ≥ 5,00 x 108 CFU/g Sử dụng cám gạo là cơ chất.
3.4. Khả năng chịu đựng ô nhiễm và hấp thụ KLN của thực vật
Khả năng sinh trưởng của đậu bắp, đậu rồng, rau ngót và dọc mùng trong đất ở các nồng độ KLN khác nhau và chế phẩm dạng 1 ở bảng 3.17 cho thấy:
Đối với Pb, khi tăng nồng độ Pb trong đất, khả năng sinh trưởng của cả 4 cây trồng bị ảnh hưởng. Tổng sinh khối khô của cây giảm ở các công thức có gây ơ nhiễm Pb so với đối chứng. Trong đó, tổng sinh khối khô cao nhất ở công thức 3 (350 ppm Pb) của cây dọc mùng là 36,08 g/cây và thấp nhất ở công thức 4 (700 ppm Pb) của cây đậu rồng 13,80 g/cây.
Pb được tích lũy nhiều ở phần khơng sử dụng của 4 loại thực vật và hàm lượng tích lũy tăng theo hàm lượng Pb có trong đất.
Sự tích lũy KLN trong cây đậu bắp được thể hiện ở bảng 3.17
Đối với cây đậu bắp, Pb tích lũy trong thân lá từ 15,13 ppm Pb ở đất nền đến 175 mg/kg chất khô ở công thức ô nhiễm cao (700 ppm Pb), trong rễ khô hàm lượng chì từ 37.59 ppm đến 188,18 ppm Pb, trong quả tươi từ 0,033 ppm đến 0,172 ppm Pb, trên các chân đất tương ứng.
Hàm lượng Cadimi (Cd) tích lũy trong thân lá từ 0.62 ở đất nền đến 7,14 mg/kg chất khô ở công thức ô nhiễm cao (700 ppm Cd), trong rễ khô hàm lượng Cd từ 13.48 ppm đến 48.74 ppm Cd, trong quả tươi từ 0,07 ppm đến 0,115 ppm Cd, trên các chân đất tương ứng,