2.2.2 .Phƣơng pháp tính tốn lý thuyết
4.1. CHẾ TẠO CẢM BIẾN GLUCOSE SỬ DỤNG CÁC HẠT NANO PbS
4.1.1. Thiết kế cảm biến và phƣơng pháp đo đạc
4.1.1.1. Thiết kế cảm biến
Nguyên lý hoạt động cảm biến sinh học điện hóa sử dụng các hạt nano PbS trong luận án này là cảm biến sinh học thế hệ III, dựa vào tƣơng tác enzyme – cơ chất. Đối tƣợng cần nhận biết là glucose, phần tử nhận biết là enzyme glucose oxidase (GOx) và tín hiệu của cảm biến là tín hiệu I-V thế qt vịng. Glucose bị ơ xi hóa thành glucolactone (phƣơng trình 1.2) nhờ sự xúc tác của enzyme GOx. Điện tử tham gia vào q trình ơ xi hóa xuất phát từ điện cực, đƣợc trao đổi với các phân tử glucose thông qua vật liệu làm điện cực - ở đây là PbS. Phƣơng pháp đo thể quét
vòng gắn liền với 3 điện cực: điện cực làm việc WE, điện cực đến CE và điện cực tham chiếu RE. Quy trình chế tạo điện cực làm việc đƣợc mơ tả nhƣ trong hình 4.1; đƣợc chia làm 3 bƣớc: tạo điện cực vàng, tạo hỗn hợp PbS-GOx và nhỏ dung dịch chứa hỗn hợp PbS-GOx lên điện cực để tạo thành màng không tan trong nƣớc.
Chế tạo điện cực vàng
Điện cực vàng đƣợc thiết kế sao cho có diện tích bề mặt cố định và hơi sâu xuống so với mặt thống 1 mm để có thể giữ đƣợc 1 giọt hỗn hợp chứa PbS-GOx. Cụ thể, một miếng vàng có dạng trụ đƣờng kính 3 mm, dài 1 mm đƣợc đặt cố định vào trong một ống Teflon – điện cực vàng. Điện cực vàng đƣợc nối ra ngoài nhờ một lõi dẫn điện bằng đồng (Cu) chạy suốt dọc ống Teflon. Epoxy đƣợc đổ vào lõi trụ sao cho liên kết giữa sợi đồng và điện cực vàng cố định, vừa để giúp hệ lõi sợi đồng-điện cực vàng có thể trƣợt dọc theo ống trụ Teflon. Mỗi lần chuẩn bị mẫu, điện cực vàng đƣợc trƣợt ra ngồi một chút để mài phẳng; sau đó đẩy lùi lại so với mặt thoáng của ống Teflon 1 mm.
Tạo hỗn hợp PbS-GOx
Các hạt PbS đƣợc pha vào trong dung dịch muối phosphate (Phosphate Buffer – PBS) có pH 7 trong đó đã có chứa các phân tử enzyme Glucose oxidase (GOx) nồng độ 0,2 M (Dung dịch PbS+GOx). Để khơ ở trong điều kiện thống tại 4oC để cho dung dịch khô hết – lúc này các phân tử GOx có thời gian để hấp phụ lên trên bề mặt của các hạt PbS. Sau khi dung dịch PbS+GOx khơ, nhỏ dung dịch polystyrene (PS) đƣợc hịa tan trong dichloromethane (CH2Cl2) vào sao cho tổng thể tích của hệ bằng đúng thể tích của dung dịch PbS+GOx trƣớc khi khơ. CH2Cl2khơng gây độc tính phá hủy enzyme, là chất hòa tan tốt PS và bay hơi rất nhanh. Hỗn hợp chứa PS, PbS và GOx tan trong CH2Cl2 đƣợc khuấy đều và nhỏ một giọt lên trên bể mặt điện cực vàng.
Hình 4.1. Mơ tả cấu tạo điện cực làm việc của cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose có sử dụng các hạt nano PbS.
Cố định PbS-GOx lên bề mặt điện cực
Điện cực đƣợc mài phẳng và để thụt vào so với mặt thoáng 1 mm. Nhỏ 1 mL dung dịch chứa hỗn hợp PbS-GOx lên mặt thoáng của điện cực. Sau 10 phút, CH2Cl2 bay hơi hết, trên bề mặt điện cực chỉ còn lại một lớp PbS-GOx đã đƣợc phân tán và cố định trong polystyrene (PS). Lớp PS này không tan trong nƣớc vì vậy đảm bảo các hạt nano PbS và GOx không bị phân tán vào dung dịch trong suốt quá trình đo đạc. Bên cạnh đó, việc phân tán đều PbS-GOx vào trong PS cũng tạo ra sự liên kết giữa các phân tử GOx cũng nhƣ các hạt PbS với dung dịch và điện cực vàng.
4.1.1.2. Phương pháp đo đạc
Đặc trƣng I-V hiệu thế quét vòng đƣợc đo trên máy PGSTAT302N với hệ 3 điện cực bao gồm điện cực chuẩn RE là điện cực Ag/AgCl bão hòa, điện cực đếm CE làm bằng Pt và điện cực làm việc WE đƣợc chế tạo nhƣ trong phần 4.1.1.1. Đặt hiệu điện thế quét vòng lên điện cực làm việc, khoảng làm việc [-0.1, +1,5], tốc độ quét 50 mV/s. Khoảng cách giữa điện cực làm việc và điện cực đếm đƣợc giữ nguyên là 1 cm. Bố trí thí nghiệm đƣợc làm lặp lại giống nhƣ trong cơng bố trƣớc đó về cảm biến sinh học xác định nồng độ glucose sử dụng tetrapod ZnO để so sánh kết quả [70].
4.1.2. Kết quả và thảo luận
Phép đo sử dụng hiệu điện thể quét vòng đƣợc thực hiện thêm trên hệ dung dịch chứa chỉ có glucose, glucose oxidase và hỗn hợp glucose+glucose oxidase trong PBS pH 7; điện cực sử dụng là điện cực vàng để khảo sát q trình ơ xi hóa khử của glucose cũng nhƣ vai trò của GOx trong dung dịch (hình 4.2).
Hình 4.2. Vai trị của GOx trong q trình ơ xi hóa của glucose và cảm biến xác định nồng
độ glucose bằng điện cực vàng. Hình A là kết quả đo thế quét vòng (CV) của dung dịch chứa 0,2 mM GOx, chứa 0,2 mM glucose và chứa hỗn hợp 0,2 mM glucose và 0,2 mM GOx. Hình B là kết quả đo CV của dụng dịch chứa hỗn hợp của 0,2 mM GOx với glucose với các nồng độ khác nhau.
Khi trong dung dịch chỉ có glucose 0,2 mM pha trong PBS pH 7 nhận thấy xuất hiện đỉnh khử tại 0,14 V. So sánh với kết quả đƣợc cơng bố bởi Hsiao [41], thấy vị trí đỉnh khử này rất trùng với vị trí đỉnh khử của dung dịch chứa sodium gluconate. Theo Hsiao, sản phẩm của quá trình khử trong giản đồ CV của sodium gluconate là glucolactone. Nhƣ vậy, có thể giả thiết glucose đƣợc ơ xi hóa thành a xít gluconic (là a xít của muối gluconate) khi điện thể của WE tăng từ -0,1 V đến 1,5 V. Sau đó, ở chiều ngƣợc lại, khi điện thể của WE giảm từ 1,5 V xuống -0,1 V thì a xít gluconic bị khử thành glucolactone; vị trí đỉnh khử là 0,14 V.
Khi trộn hai dung dịch GOx và glucose lại, nhận thấy có sự dịch đỉnh về phía giữa của hai đỉnh của mẫu khi chỉ có Glocose hay GOx độc lập. Vị trí đỉnh I-V thu đƣợc là 0,45 V. Điều này cũng đƣợc nhóm Qing Liu thảo luận và đƣợc cho là có sự tƣơng tác giữa GOx và glucose trong dung dịch [68]. Trong dung dịch, các phân tử glucose có kích thƣớc rất nhỏ, trong khi đó các phân tử GOx có 580-585 acid amin của mình có kích thƣớc lớn hơn rất nhiều với cấu hình 3D đƣợc chia làm 2 domain (N-terminal và C-terminal) [40]. Các phân từ glucose liên kết vào bên C-terminal và sẽ chƣa chuyển hóa thành a xít gluconic khi chƣa có phân tử FAD (flavin adenine dinucleotide) nào liên kết với N-termial. FAD giống nhƣ chất xúc tác, chuyển hóa thành FADH2 (nhận thêm H từ mơi trƣờng, vì vậy tạo ra H2O2 nhƣ là sản phẩm ở trong dung dịch), kích hoạt GOx thay đổi cấu hình, kích hoạt q trình chuyển hóa glucose thành a xít gluconic. Vì vậy, khi nồng độ glucose tăng lên thì cƣờng độ dịng khử GOx cũng tăng lên nhƣ biểu hiện trong hình 4.2B.
Hình 4.3. So sánh kết quả đo điện thế quét vòng (CV) của dung dịch chứa 0,2 mM glucose khi sử dụng điện cực chế tạo từ PbS-GOx với kết quả đo CV của mẫu dung dịch chứa GOx.
Khi dùng hệ điện cực đƣợc chế tạo từ PbS-GOx, xuất hiện hai đỉnh khử tại 0,49 V và 0,14 V. Hai đỉnh này rất gần với vị trí đỉnh khử của GOx và của a xít gluconic với cƣờng độ tăng lên gần 15 lần (hình 4.3). Nhƣ vậy, trong quá trình khử sẽ xuất hiện cả sự khử của a xít gluconic thành glucolactone và q trình kích hoạt của GOx. Khơng chỉ vậy, cịn thấy xuất hiện thêm một đỉnh rất cao tại đƣờng cong ơ xi hóa – khi điện thể của WE tăng từ -0,1 V đến 1,4 V. Vị trí đỉnh này tại 1,14V. Theo nghiên cứu của Cuharuc, q trình ơ xi hóa của PbS thành HPbO2 cũng đƣợc đo trong khoảng này [22]. Nhƣ vậy, quá trình ơ xi hóa glucose thành glucolactone gắn liền với q trình hoạt hóa GOx và ơ xi hóa của PbS trên bề mặt điện cực.
Hình 4.4. Kết quả đo CV của dung dịch chứa glucose với nồng độ tăng từ 0,1 M đến 1,3 M trên hệ điện hóa với điện cực WE có PbS-GOx.
Hình 4.4 là kết quả đo CV của dung dịch chứa glucose với nồng độ tăng dần từ 0,1 mM đến 1,3 mM – điện cực sử dụng là điện cực có PbS-GOx. Khi nồng độ glucose tăng lên, số điện tử cần để hoạt hóa GOx cũng tăng lên, dẫn tới cƣờng độ dòng khử tại đỉnh 0,49 V cũng tăng lên. Tƣơng tự vậy, cƣờng độ dịng ơ xi hóa của
Trong trƣờng hợp lý tƣởng, mỗi một phân tử glucose bám vào một phân tử GOx sẽ bị ơ xi hóa thành glucolactone bằng 2 electron. Hai electron này sẽ chuyển qua GOx để tới bề mặt điện cực. Glucolactone khơng bền và chuyển hóa thành a xít gluconic. Theo định luật Fick, tại trạng thái cân bằng – khi khơng có các hoạt động khử, ơ xi hóa thì lƣợng glucose hấp phụ trên bề mặt điện cực tỉ lệ thuận với nồng độ của glucose và diện tích bề mặt điện cực. Vì vậy, cƣờng độ dịng điện điện hóa chuyển qua trên bề mặt điện cực sẽ tuân theo công thức Randles-Sevcik (công thức 2.7) 2 1 * 0 RT nFvD KnFAC iP O
Ở đây A khơng chỉ là diện tích nhìn thấy của điện cực mà là diện tích tiếp xúc của chất bị khử/ơ xi hóa với bề mặt điện cực và D0 ở đây khơng chỉ cịn là hằng số khuếch tán đơn thuần mà còn là hệ số biểu hiện khả năng khuếch tán/ chuyển tiếp của electron từ mẫu vào đến điện cực, thậm chí cịn phụ thuộc vào thế năng ơ xi hóa
khử của đối tƣợng khảo sát. Giá trị C0* lúc này tỉ lệ với nồng độ của glucose có trong dung dịch (khi lƣợng GOx đã đƣợc cố định). Nhƣ vậy, ta có thể viết lại cơng thức 2.10 cho phù hợp với cảm biến đã thiết kế:
vl e glu hd P KA C D i cos (4.1)
Trong đóAhdvà Dvllà diện tích điện cực hiệu dụng và hệ số đặc trƣng cho độ khuếch tán electron của vật liệu và K là hằng số. Theo nhƣ cơng thức này thì cƣờng độ dịng tại đỉnh ơ xi hóa khử sẽ tỉ lệ thuận với nồng độ của glucose trong dung dịch. Giá trị này cũng sẽ không tăng mãi khi nồng độ glucose tăng lên mà sẽ dần đạt đến bão hòa khi hàm lƣợng glucose quá lớn, dẫn đến lƣợng glucose bám vào C-domain của GOx đạt tới hạn. Mặc dù vậy, ta có thể khảo sát đƣợc bản chất q trình điện hóa dựa vào khoảng tuyến tính của độ thị biểu diễn sự phụ thuộc của iP vào Cglucose.
Hình 4.5. So sánh độ nhạy của cảm biến glucose đo trên hệ điện cực PbS với cảm biến glucose đo trên điện cực vàng. Hình A là kết quả tính tốn độ nhạy cảu cảm biến từ đỉnh khử tại 0,45 V với điện cực WE có PbS-GOx. Hình B là kết quả tính tốn từ đỉnh khử tại 0,45 V với điện cực vàng.
Xét quá trình khử, tại đỉnh 0,45 V, nhận thấy sự phụ thuộc của cƣờng độ dòng điện khử tại 0,45 V vào nồng độ của glucose trong dung dịch (Cglucose) đƣợc chia thành hai khoảng ứng với Cglucose< 0,8 mM và Cglucose> 0,8 mM. Độ dốc của hai đoạn này khác nhau, và có giá trị nhỏ hơn khi Cglucose < 0,8 mM.
Sử dụng công thức 4.1, ta nhận đƣợc hệ số nghiêng của đồ thị là KAhdReDvlRe = 23,2 ± 1,5 μAmM-1 khi Cglucose> 0,8 mM và bằng 5,8 ± 0,5 μAmM-1 khi Cglucose< 0,8 mM. Trong đó Re
hd
A và Re
vl
D làdiện tích hiệu dụng và hằng số khuếch tán đối với trƣờng hợp WE đƣợc chế tạo từ PbS-GOx. Diện tích hiệu dụng của điện cực vàng khi chƣa có vật liệu PbS là 2
R
mm.Từ đóđộ nhạy của cảm biến đƣợc tính và bằngS1Re= 82,1 ± 5,3 μAcm-2mM-1 khi Cglucose> 0,8 mM và S2Re= 20,5 ± 1,8 μAcm-2mM-1 khi Cglucose< 0,8 mM. Độ nhạy của cảm biến xác định nồng độ glucose khi điện cực WE khơng có PbS-GOx, ta cũng tính đƣợc KAhd0 D0= 0,275 ± 0,06 μAmM-1. Ở đây 0
hd
A và D0lần lƣợt là diện tích hiệu dụng và hằng số khuếch tán đối với trƣờng hợp chỉ có điện cực vàng. Từ đây, độ
nhạy của cảm biến khi chỉ dùng điện cực vàng là S0= 1,0 ± 0,2 μAcm-2
mM-1 (hình 4.5B). Nếu coi hệ số K là khơng đổi thì độ nhạy của cảm biến tăng lên tới 82 lần, so với khi dùng điện cực Au.
Hình 4.6. Tính tốn độ nhạy của cảm biến từ đỉnh ơ xi hóa tại 1,14 V với điện cực làm việc WE có PbS-GOx.
Tƣơng tự vậy, khi khảo sát độ nhạy của cảm biến tại vị trí ơ xi hóa của PbS (hình 4.5B), ta nhận đƣợc S1PbS= 546,2 ± 24,6 μAcm-2mM-1 khi Cglucose> 0,8 mM và
PbS
S1 = 322,1 ± 8,6 μAcm-2mM-1 khi Cglucose< 0,8 mM. Ở đây, có thể lƣu ý là diện tích hiệu dụng đều đƣợc tính là tổng diện tích bề mặt tiếp xúc của PbS, nên giá trị có thể coi là khơng đổi. Vì vậy sự khác biệt là do bản chất q trình ơ xi hóa của PbS thành HPbO2 và quá trình khử của GOx. Mặc dù vậy, sự khác biệt này cũng không quá nhiều (khoảng 3,9 lần).
So sánh kết quả này với kết quả đã cơng bố trƣớc đó với điện cực làm từ tetrapod ZnO – độ nhạy khi đó là 166,7 ± 8,3 μAcm-2mM-1[70]; ta nhận đƣợc độ nhạy của cảm biến tăng lên 3 lần. Kết quả này có thể là do các phân tử GOx khi hấp phụ trên bề mặt của vật liệu, chúng ƣu tiên liên kết chặt chẽ với các hạt nano PbS hơn là so với ZnO.Trong cấu trúc 3D của GOx, vị trí liên kết với FAD – hay chính là nơi liên kết để chuyển tiếp electron, rất gần với amino axit cystein tại vị trí thứ 512 – là amino acid đặc trƣng có gốc thiol (-SH). Vì vậy, khi hấp phụ lên bề mặt của PbS, các phân tử GOx có thể chủ động liên kết cộng hóa trị với amino axit này, giúp cho quá trình chuyển tiếp electron giữa vật liệu và GOx trở nên dễ dàng hơn. Nhƣ vậy, bằng thiết kế tƣơng tự, khi sử dụng vật liệu nano PbS, cảm biến sinh học nhận biết nồng độ glucose cho độ nhạy có thể so sánh đƣợc so với các nghiên cứu khác nhƣ nghiên cứu của Wang sử dụng vật liệu nano vàng trên dây nano Pb (135,5 μAcm- 2
mM-1) [122], của Ahmad trên thanh ZnO (106,6 μAcm-2mM-1) [2] và của Chen (711,1 μAcm-2mM-1) sử dụng vật liệu nano vàng trên điện cực grapheme [19]. Độ nhạy lớn nhất theo tìm hiểu của chúng tơi đƣợc cơng bố bởi nhóm Chen năm 2011 đạt 711,1 μAcm-2
mM-1. Dựa vào phƣơng pháp chế tạo điện cực, có thể thấy diện tích điện cực của nhóm Chen xấp xỉ bằng diện tích điện cực cơng bố trong luận án này. Nhƣng quá trình chế tạo điện cực của nhóm Chen đƣợc chia làm 2 bƣớc, lần lƣợt là (i) cố định một lớp graphene sau đó (ii) phủ một lớp hạt nano vàng lên trên bề mặt điện cực, trƣớc khi sử dụng điện hóa để gắn các phân từ GOx. Quá trình này phức tạp hơn rất nhiều so với q trình chế tạo điện cực trong luận án. Khơng chỉ vậy, vật liệu PbS sử dụng trong luận án cũng đơn giản hơn so với vật liệu đƣợc nhóm Chen sử dụng. Ngƣợc lại, độ nhạy cao nhất đo đƣợc trong luận án đạt 546,2 μAcm-2mM-1; không thấp hơn quá nhiều so với độ nhạy đƣợc nhóm Chen cơng bố.
4.1.3. Tƣơng tác giữa hạt PbS với phân tử 4-ATP
Nhƣ đã bàn luận ở phần trƣớc, luận án đã đề xuất giả thiết về khả năng liên kết giữa các hạt PbS với các gốc liên kết thiol (-SH) của phân tử GOx. Để đơn giản hóa, tƣơng tác giữa các hạt PbS và các phân tử hữu cơ có kích thƣớc nhỏ chứa gốc thiol - ở đây là 4-ATP (4-aminothiophenol) - đƣợc đánh giá thơng qua tính tốn mơ phỏng. Phƣơng pháp tính tốn đƣợc mơ tả nhƣ trong hình 4.7. Đầu tiên, phân tử 4-