CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.8. Thiết kế vector biểu hiê ̣n gen mã hóa protease HIV-1 trong E coli
Cắt vector nhân dịng mang đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện bằng enzyme giới hạn
Vector nhân dòng (pCR2.1 hoặc pGEM T) tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa cho protease HIV-1 đƣợc xử lý với cặp enzyme giới hạn có trình tự cắt đã thiết kế thêm trên các cặp mồi để thu đƣợc đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và cũng để tạo đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời, vector biểu hiện cũng đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzyme giới hạn với vector nhân dòng để tạo đầu dính tƣơng thích. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bao gồm: 6 l đệm II 10X, 30 l vector, 2 l enzyme giới hạn, bổ sung dd H2O cho đủ 60 l.
Hỗn hợp phản ứng sau khi đƣợc hòa tan theo đúng tỉ lệ sẽ đƣợc ủ ở 37oC qua đêm, tạo sản phẩm cắt hoàn toàn.
Tinh sạch sản phẩm cắt giới hạn bằng kit thôi gel của Bioneer
Sau khi cắt bằng enzyme giới hạn, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và đoạn vector biểu hiện dạng mạch hở đƣợc tinh sạch (bằng kit thôi gel của Bioneer) nhằm loại bỏ các thành phần enzyme thừa và tăng nồng độ, chuẩn bị cho phản ứng gắn. Theo quy trình này trƣớc tiên, sản phẩm cắt enzyme giới hạn cần đƣợc chạy trên gel agarose 1% để phân tách các băng. Sau đó, bản gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng UV và vị trí băng DNA khoảng 300 bp của đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện dạng mạch hở với kích thƣớc phù hợp đƣợc cắt ra và cho vào trong ống eppendorf 1,5 ml. 5 lần thể tích đệm GB (Gel Binding Buffer) đƣợc bổ sung vào 1 thể tích đoạn gel đã cắt. Hỗn hợp đệm và gel sau đó đƣợc đun ở 60oC trong khoảng 10-15 phút để gel tan hết. Sau khi gel tan hoàn toàn, hỗn hợp phản ứng đƣợc đƣa lên cột thơi gel, cột sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong vòng 1 phút, 40C. Phần dịch dƣới cột đƣợc đổ bỏ. Cột đƣợc rửa 2 lần bằng 500 l đệm rửa WB (Wash Buffer). Sau đó, DNA gắn trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 30-
60 l đệm EL (Elute Buffer). Cột đƣợc ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút ở
nhiệt độ phòng. DNA trong dịch ly tâm đƣợc thu nhận và giữ ở -20oC cho đến khi sử dụng.
Gắn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện
Sau khi tinh sạch, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện đƣợc gắn với nhau nhờ enzyme nối T4 DNA ligase theo tỷ lệ đoạn gen và vector là 3:1, tổng thể tích phản ứng gắn 10-20 l. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC qua đêm và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5. Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa
thạch đƣợc sàng lọc bằng PCR trực tiếp, sau đó khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc lựa chọn để tách plasmid tái tổ hợp. Các plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 (tƣơng tự nhƣ đã đƣợc trình bày ở mục 2.3.6).
Ni cấy tế bào vi khuẩn E. coli BL21 và thu protein tổng số trong phân đoạn dịch chiết và kết tủa tế bào
Tế bào E. coli BL21 có chứa vector biểu hiện tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc nuôi cấy khởi động trong 4 ml mơi trƣờng LB lỏng có kháng sinh ampicilin 50 µg/ml và chloramphenicol 34 g/ml trong 14-16 giờ. Mơi trƣờng ni cấy sau đó đƣợc trẻ hóa trong 100 ml LB lỏng bằng cách bổ sung thêm 30-50 lần thể tích LB và tiếp tục đƣợc ni cấy tới khi A600 đạt 0,7-0,8, IPTG đƣợc bổ sung đạt nồng độ cuối cùng 0,1-0,25 mM để cảm ứng sinh tổng hợp protein đích. Sau 3 giờ ni cấy, tế bào đƣợc thu lại bằng cách ly tâm dịch ở 6.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC và sinh khối tế bào đƣợc hòa lại trong 3 ml đệm A (Tris HCl 20 mM, pH 7,9, NaCl 100 mM, PMSF 1 mM, imidazol 5 mM). Tế bào đƣợc phá vỡ bằng siêu âm 4 lần, mỗi lần 30 giây. Dịch siêu âm đƣợc ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút, 4oC để thu protein tổng số trong dịch chiết tế bào. Phần tủa tế bào sau đó đƣợc hịa tan bằng 3 ml đệm A có urea 8 M, khơng có PMSF và đƣợc lắc trong 30 – 60 phút để hịa tan hồn toàn các protein trong phân đoạn tủa.
Đối với các thí nghiệm chỉ thu protein trong phân đoạn tủa mà không thu protein trong dịch chiết tế bào, các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Sau khi dừng nuôi cấy và ly tâm thu tế bào, tế bào đƣợc hòa lại trong 3 ml đệm Tris-HCl 20 mM, pH 7,9; phá vỡ tế bào bằng siêu âm 4 lần, mỗi lần 10 giây; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC, loại bỏ dịch nổi, thu tủa tế bào. 3 ml đệm B (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 100 mM, Triton X-100 1%) đƣợc bổ sung vào để hòa tan tế bào, tiếp tục phá vỡ tế bào bằng siêu âm 4 lần, mỗi lần 10 giây; sau siêu âm lắc rửa tế bào 30 – 60 phút ở nhiệt độ phịng. Bƣớc này nhằm loại
bỏ bớt các protein khơng mong muốn của tế bào và đƣợc lặp lại 2 lần, lần thứ 3 rửa bằng H2O cất hai lần để loại bỏ hết Triton X-100. Cuối cùng tủa tế bào đƣợc hòa tan trong 3 ml đệm C (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 100 mM, urea 8M, imidazol 5 mM); lắc trong vòng 30 – 60 phút để hịa tan hồn tồn protein.