CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.9. Sắc ký protein qua cột ái lực Ni-agarose hoặc His-bind
Nguyên tắc của phƣơng pháp sắc ký này dựa trên liên kết đƣợc tạo ra giữa những protein có chứa trình tự 6-8 gốc histidine (His-tag) với ion Ni2+ trong thành phần gel Nickel-agarose hoặc gel His-bind. Khi cho qua cột, các protein mang đuôi His-tag này sẽ đƣợc gel giữ lại do có khả năng tạo phức với Ni2+. Sau đó, các protein gắn với gel đƣợc rửa chiết ra bằng các dung dịch Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 hoặc bằng dung dịch Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có urea 8M trong điều kiện biến tính với nồng độ imidazol khác nhau (nhờ khả năng cạnh tranh liên kết với gốc Ni2+ của các phân tử imidazol).
Protease HIV-1 tái tổ hợp đƣợc biểu hiện bằng hệ thống vector pET có gắn đuôi His-tag ở đầu N hoặc C nên có thể tinh sạch đƣợc bằng cột sắc ký ái lực Nickel-agarose hoặc His-bind.
Gel Nickel-agarose hoặc gel His-bind đƣợc nhồi vào cột (kích thƣớc 3x1 cm) để có thể tích cột gel 2,5 - 3 ml. Đối với gel His-bind phải có thêm bƣớc tích ion Ni2+ (dƣới dạng muối NiCl2) bằng cách cho 5 lần thể cộtgel NiCl2 50 mM chảy qua với tốc độ 15-20 ml/giờ. Cột gel đƣợc cân bằng với đệm A bằng cách cho 5 lần thể tích cột gel của đệm gắn cột chảy qua với tốc độ 20-30 ml/giờ.
Protease HIV-1 đƣợc tinh sạch trong hai điều kiện khơng biến tính nhằm tinh sạch protease HIV-1 trong dịch chiết tế bào và điều kiện biến tính nhằm tinh sạch protease HIV-1 trong phân đoạn tủa tế bào. Sự khác nhau là trong điều kiện biến tính tất cả các đệm cân bằng, rửa cột và chiết protein đều phải có urea 8M.
Phân đoạn protease HIV-1 sau tinh sạch trong điều kiện biến tính đƣợc pha lỗng về nồng độ khoảng 0,01 - 0,1 mg/ml và cho thẩm tích đổi đệm D (Tris-HCl 20 mM, pH 7,9 có NaCl 50 mM, DTT 1 mM, -mecaptoethanol (-ME) 1 mM, glycerol 5% với nồng độ urea giảm dần từ 8 M đến 0 M. Sau khi thẩm tích, mẫu đƣợc cơ bằng centricon 3 kDa, tốc độ ly tâm 6.000 vòng/phút, ở 4oC đến khi hàm
lƣợng protein đạt từ 0,1 đến 1 mg/ml; chế phẩm đƣợc bảo quản ở -80oC cho đến khi dùng.