Cơ chế kháng thuốc của đô ̣t biến I50L

(A và B) atazanvir (carbon màu xanh biển); (C và D) ritonavir (carbon màu ngọc lam); (A và C) protease bình thƣờng (carbon màu xám); (B và D) protease mang đột biến thay thế I50L/A71V (carbon màu vàng). Lực van der Waal giữa I50 và nhóm tert-butyl tại P2’ trở thành cản trở khơng gian khơng thích hợp với đột biến thay thế I50L. Trong khi đó lực van der Waals yếu và xa giữa I50 và dimethyl tại P2’ trở nên gần và thuận tiện với L50. Màu của các nguyên tử không phải carbon bao gồm: hidro – màu trắng, oxy – màu đỏ, nitro - màu xanh, sunfua – vàng tối

Hƣớng nghiên cứu về đột biến kháng thuốc gần đây rất đƣợc quan tâm là kiểu gen và con đƣờng kháng thuốc ở các phân nhóm HIV-1 khác nhau liệu có giống nhau hay khơng. Do trình tự nucleotide trong gen pol có sự đa dạng khác

nhau từ 10 đến 15% giữa các phân nhóm, đột biến axit amin có thể nhanh chóng dẫn đến sự thay thế hoặc kháng thuốc trong ART nên các HIV-1 khơng phải phân nhóm B có thể đƣợc cho rằng đã tiến hóa khác phân nhóm B và mơ hình hay con đƣờng kháng thuốc có thể khác nhau (Ariyoshi và tâ ̣p thể , 2003; Abecasisa và tâ ̣p thể, 2005; Kantor và tâ ̣p thể, 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể, 2008). Tuy nhiên, các nghiên cứu sản xuất thuốc và cơ chế di truyền kháng thuốc PI chủ yếu dựa trên HIV-1 thuộc phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Australia chỉ gây ra sự truyền nhiễm HIV-1 chiếm tỷ lệ khoảng 12% trên toàn thế giới còn lại là do các virus khơng phải phân nhóm B gây ra nhƣng các nghiên cứu vẫn còn nhiều hạn chế (Ariyoshi và tâ ̣p thể , 2003). Do hầu hết thông số kháng thuốc ở HIV cho đến nay chủ yếu liên quan đến phân nhóm B, nên gần đây các nghiên cứu tập trung nhiều vào sự khác nhau trong trình tự axit amin liên quan đến mức độ kháng thuốc PI ở các phân nhóm khác nhằm tối ƣu hóa điều trị kháng thuốc ở các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm này (Ariyoshi và tâ ̣p thể , 2003; Abecasisa và tâ ̣p thể , 2005; Kantor và tâ ̣p thể, 2005; Bandaranayake và tâ ̣p thể, 2008). Số liệu từ các nghiên cứu đã cho thấy kiểu gen kháng thuốc ở phân nhóm B khơng phải ln ln có thể áp dụng cho các phân nhóm khác B.

Năm 2003, Ariyoshi và tâ ̣p thể ở trung tâm nghiên cứu AIDS Nhật Bản đã tiến hành so sánh các đột biến kháng thuốc ở các virus thuộc phân nhóm CRF01_AE với phân nhóm B trên các bệnh nhân nhiễm HIV-1 thất bại với phác đồ điều trị bằng ART. Kết quả cho thấy các đột biến đã biết tại các vị trí L10F, K20I, L33I và N88S xuất hiện ở protease HIV-1 của các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE nhiều hơn so với phân nhóm B. N88S có vai trò quan trọng trong kháng thuốc nelfinavir ở các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE trong nghiên cứu. Tuy nhiên, N88S đã đƣợc thông báo kháng với các thuốc nelfinavir, indinavir và BMS-232632 ở phân nhóm B (Gong và tâ ̣p thể , 2000). Thêm nữa, các bệnh nhân mang N88S ở phân nhóm CRF01_AE lại ln có đột biến L10F, trong khi ở phân nhóm B khơng có bệnh nhân nào mang cả hai đột biến liên kết này.

Khơng có bệnh nhân nào kháng PI nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE mang các đột biến D30N, A71V hoặc N88D, trong khi những đột biến này thƣờng xuất hiện ở phân nhóm B kháng PI. Các kết quả đƣợc khẳng định thêm cùng với các số liệu so sánh đột biến kháng thuốc trên gen mã hóa reverse transcriptase. Nhóm tác giả khẳng định rằng các nghiên cứu đã biết về kiểu gen gây đột biến kháng thuốc ở phân nhóm B khơng phải lúc nào cũng có thể đúng với phân nhóm CRF01_AE, đặc biệt trong trƣờng hợp các bệnh nhân nhiễm HIV-1 phân nhóm CRF01_AE đƣợc điều trị bằng nelfinavir.

Năm 2005, để trả lời hai câu hỏi: i) các đột biến gây kháng thuốc ở phân nhóm B có áp dụng đƣợc với các phân nhóm khác B hay khơng; ii) liệu có các đột biến mới dẫn đến thất bại trong điều trị HIV-1 ở các phân nhóm khác B nhƣng có trong phân nhóm B hay khơng; Kanto và tập thể đã nghiên cứu các đột biến trong gen mã hóa protease và reverse transcriptase phân lập từ các bệnh nhân nhiễm HIV- 1 đang điều trị bằng PI và các thuốc ức chế reverse transcriptase trong 14 phịng thí nghiệm tại 12 nƣớc trên thế giới. Kết quả cho thấy, 1 trong 55 đột biến kháng thuốc ở phân nhóm B đã biết xảy ra ít nhất một lần ở các phân nhóm khơng phải B. Trong đó, 80% đột biến có vai trị quan trọng trong liệu pháp điều trị ART ở các bệnh nhân nhiễm HIV-1 khơng phải phân nhóm B. Có 11 đột biến khơng phổ biến ở phân nhóm B nhƣng lại có trong tất cả các phân nhóm khác B và rất khó để xác định xem chúng có vai trị trong điều trị hay khơng. Nghiên cứu cũng cho thấy khơng có đột biến nào gây kháng thuốc ở các phân nhóm khơng phải B mà khơng liên quan đến kháng thuốc ở phân nhóm B. Nhóm tác giả khẳng định, các nỗ lực giải quyết hiện tƣợng kháng thuốc trong điều trị HIV/AIDS trƣớc hết nên tập trung vào các đột biến ở phân nhóm B đã biết.

Tuy nhiên, cùng năm 2005, Abecasis và tập thể đã phát hiện thấy rằng đột biến M89I/V ở các bệnh nhân điều trị thất bại với thuốc PI mang HIV-1 thuộc các phân nhóm C, F và G nhƣng khơng gây đột biến kháng thuốc ở các phân nhóm B. Ở các virus mang đột biến L90M, việc xuất hiện thêm M89I/V đã dẫn đến kháng với thuốc nelfinavir.

Cùng quan điểm với các nhóm nghiên cứu của Ariyoshi và tâ ̣p thể (2005), Abecasis và tâ ̣p thể (2005); Bandaranayake và tập thể (2008) đã phân tích cấu trúc

tinh thể của phức hợp protease HIV-1 phân nhóm CRF01_AE với cơ chất p1-p6 và so sánh với cấu trúc của protease HIV-1 phân nhóm B. Kết quả cho thấy phần khớp nối giữa vùng mũ và vùng lõi protease phân nhóm CRF01_AE có sự sắp xếp lại và có ý nghĩa quan trọng so với cấu trúc protease phân nhóm B. Nhóm tác giả khẳng định rằng sự thay đổi cấu trúc này có thể ảnh hƣởng đến tƣơng tác của protease phân nhóm CRF01_AE với các PI và do đó mức độ kháng thuốc với các chất ức chế có thể khác so với protease phân nhóm B. Tóm lại, dù cịn nhiều tranh cãi nhƣng HIV-1 thuộc các phân nhóm khơng phải nhóm B gây ra HIV-1 chủ yếu trên thế giới cần đƣợc nghiên cứu nhiều hơn nữa nhằm có phác đồ điều trị hợp lý và hiệu quả cho các bệnh nhân nhiễm HIV-1 nhóm này.

Ở Việt Nam, ART đƣợc Bộ Y tế và Tổ chức quốc tế WHO bắt đầu đƣa vào sử dụng năm 2003 và trung bình số lƣợng bệnh nhân điều trị bằng ART đã tăng từ 1% năm 2003 lên 11% năm 2005 và 28,4% năm 2007. Do ART đƣợc đƣa vào Việt Nam nhanh chóng nên dẫn đến sự lan truyền các chủng kháng thuốc HIV-1. Tỷ lệ kháng ART nói chung trong số các bệnh nhân chƣa điều trị ART ở thành phố Hồ Chí Minh năm 2003 là 6,5%; ở Hà Nội là 5% năm 2006 và 2,9% ở Hải Phòng năm 2009 (Phan và tập thể , 2010). Năm 2009, Ishizaki và tập thể đã phân tích gen mã hóa protease trên 294 bệnh nhân nhiễm HIV-1 chƣa dùng ART ở Hải Phòng và phát hiện đƣợc 0,3% trƣờng hợp mang đột biến M46I kháng thuốc kiểu hình với PI, 99% và 99,3% trƣờng hợp mang lần lƣợt các đột biến M36I và H69K. Ngoài ra nghiên cứu cũng phát hiện đƣợc tỷ lệ mang đột biến không kháng thuốc E35E_E (thêm một axit amin glutamic ở vị trí 35), R41K và L89M tƣơng ứng là 0,3%; 99% và 98,6%. Đến năm 2010, Phan và tập thể cũng đã phân tích gen mã hóa protease trên 174 bệnh nhân chƣa dùng ART ở một số tỉnh phía Bắc (Hà Nội, Nam Định và Thái Bình) và đã phát hiện đƣợc 1,7% trƣờng hợp mang các đột biến kháng thuốc chính bao gồm L33F, M46I, M46L và I50V. So với các nghiên cứu trƣớc đây ở Hà Nội thì tỷ lệ đột biến là 5% năm 2006 và 0,39% ở Hải Phòng năm 2009. Các nghiên cứu này cũng cho thấy đột biến PI thƣờng xuất hiện chậm và ít hơn so với các thuốc ức chế NRTI và NNRTI trong ART. Mặc dầu, đã có một số nghiên cứu trên đây về tình hình đột biến kháng thuốc PI ở Việt Nam, tuy nhiên vẫn cịn ít thơng tin về tình trạng kháng thuốc hiện

tại và theo dự đốn tỷ lệ này cịn cao hơn nữa (Nguyen và tâ ̣p thể, 2003; Ishizaki và tâ ̣p thể, 2009; Phan và tâ ̣p thể, 2010).

Mặt khác, do các đột biến chính trong gen mã hóa của protease tƣơng đối đặc hiệu cho từng loại thuốc nên nếu thay thế bằng một loại thuốc khác trƣớc khi có sự tích lũy đột biến thì các phác đồ sau vẫn thành cơng (Hoffmann và tập thể, 2007). Chính vì vậy, xét nghiệm kháng thuốc trên lâm sàng trƣớc khi thay đổi phác đồ có vai trị quan trọng trong điều trị bệnh nhân HIV/AIDS. Từ những nghiên cứu đó, các thuốc PI mới với đặc điểm kháng thuốc khác nhau đã đƣợc phát triển. Các lựa chọn điều trị sau khi thất bại đã đƣợc cải thiện và do đó tầm quan trọng của xét nghiệm kháng thuốc ngày càng tăng lên.

1.2.7. Ứng dụng các thành tựu nghiên cứu protease HIV-1

Những nghiên cứu đầy đủ về cấu trúc, cấu hình và chức năng của các protease HIV-1 là cơ sở tạo ra các PI đầu tiên vào những năm đầu thập kỷ 90. Thiết kế chất ức chế dựa trên nghiên cứu cấu trúc là ứng dụng lớn nhất của protease giúp kéo dài cuộc sống của bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS. Những chất ức chế này đã đƣợc cải biến bằng nhiều cách để chúng ăn khớp chính xác vào vị trí hoạt động của protease HIV-1 (King và tập thể, 2000).

Saquinavir là chất ức chế protease HIV-1 đầu tiên đƣợc thiết kế bởi Cục Quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ (FDA). Cơ sở của thiết kế dựa trên kiến thức về chức năng của protease HIV-1 khơng giống nhƣ các protease khác là có thể cắt các trình tự liên kết giữa Tyr-Pro hoặc Phe-Pro trên chuỗi polypeptide tiền thân của virus. Bởi vì liên kết amide của gốc Pro không dễ bị cắt bởi các endopeptidase của động vật có vú, thiết kế chất ức chế protease dựa trên tiêu chuẩn này sẽ tạo ra các chất có ái lực và đặc hiệu cao. Cùng với saquinavir, indinavir, nelfinavir và ritonavir đều đƣợc thiết kế dựa trên chức năng nhận biết trình tự axit amin này. Phần lớn các chất đều có liên kết tƣơng tự của trình tự Phe-Pro tại vị trí 167 và 168 trên gag-pol (Wlodawer và Vondrasek, 1998; King và tâ ̣p thể, 2000).

Các chất ức chế protease có thể phân chia thành hai nhóm lớn: i) các chất ức chế dựa trên peptide và ii) các chất ức chế không phải peptide (Wlodawer và Vondrasek, 1998). Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với cơ chất tự nhiên mang liên kết cắt đặc hiệu của protease HIV-1 (saquinavir, indinavir…). Chúng đƣợc thiết kế giống với dạng

trạng thái trung gian chuyển tiếp tứ diện đƣợc hình thành trong quá trình protease xúc tác. Cấu hình này giúp cho chất ức chế gắn chặt vào trung tâm hoạt động của protease (hình 1.10).