3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể cúm và bảo quản và bảo quản
- Dùng bơm tiêm lấy 2 ml máu gà từ tĩnh mạch cánh, ñể nghiêng, chờ máu ñông chắt lấy huyết thanh. Huyết thanh có thể bảo quản ở - 200C trước khi xét nghiệm.
3.3.2. Bố trí thí nghiệm
Chọn 3 gia trại nuôi gà ñẻ cho Công ty C.P tại xã Tiên Phương - huyện Chương Mỹ - thành phố Hà Nội.
Theo hướng dẫn số: 1181/TY-DT ngày 19/6/2006 của Cục thú y “Hướng dẫn sử dụng vacxin phòng bệnh Cúm gia cầm”: Thời ñiểm gà ñược 15 ngày tuổi tiêm mũi vacxin Cúm H5N1 ñầu tiên và trước ñó lấy mẫu ñể kiểm tra kháng thể cúm. Sau tiêm vacxin 30, 60, 90 và 120 ngày sau (là lúc gà ñược 45, 75,105 và 135 ngày tuổi) lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể.
ðến khi gà ñược 135 ngày tuổi tiến hành lấy máu ñể kiểm tra hiệu giá kháng thể, ñồng thời lúc này tiêm nhắc lại vacxin cúm mũi 2 (thời gian tiêm vacxin cúm mũi 2 cách mũi 1 là 4 tháng). Sau khi tiêm vacxin mũi thứ 2: 30, 60 (lúc gà ñược 165, 195 ngày tuổi) lấy máu kiểm tra hiệu giá kháng thể.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41
Bố trí thí nghiệm 1
Khảo sát ñáp ứng miễn dịch chủñộng ở gà ñược tiêm 2 lần vacxin cúm H5N1
Tuổi gà (ngày)
Thời gian lấy mẫu (ngày sau tiêm)
Lô thí nghiệm (4.500 con)
Lô ñối chứng (500 con)
Lấy 20 mẫu huyết thanh kiểm tra kháng thể cúm
trước khi tiêm
15 -
Tiêm 0,3ml vacxin cúm
H5N1 của Trung Quốc/con
Không tiêm vacxin, nuôi riêng 45 30 Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT 75 60 Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT 105 90 Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT 135 120 Tiêm 0,5ml vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc/con
Không tiêm vacxin, nuôi riêng
165 30 Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT
Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT
195 60
Lấy trứng ấp Lấy trứng ấp
Khi gà ñược 195 ngày tuổi (gà ở tuần thứ 27 ñang ñẻ rộ), tiến hành lấy trứng ñem ấp, sau 21 ngày nở ra gà con và Bố trí thí nghiệm 2.
Khảo sát ñáp ứng miễn dịch thụñộng ởñàn gà con nở ra từ trứng của gà mẹñã ñược tiêm phòng 2 mũi vacxin cúm H5N1
Thời gian lấy mẫu (ngày tuổi)
Lô thí nghiệm
(gà bố mẹ ñược tiêm vacxin)
Lô ñối chứng
(gà bố mẹ không ñược tiêm vacxin)
1 Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT
7 Lấy 30 mẫu HT Lấy 20 mẫu HT
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 42
3.3.3. P hương pháp tiến hành phản ứng HI
Sử dụng phản ứng HI ñể xác ñịnh hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà sau tiêm vacxin cúm H5N1.
3.3.3.1. Chuẩn bị dung dịch:
- Dung dịch chống ñông máu (Citrat natri 5%): Citrat natri 5g
Nước cất vừa ñủ 100ml
- Dung dịch pha loãng kháng nguyên và hồng cầu: NaCl 0,85%: NaCl 8,5g Nước cất vừa ñủ 1000ml - Dung dịch PBS 0,01M pH7.2 Na2HPO4 1,096 g Na2HPO4…H2O 0,316 g NaCl 8,5 g Nước cất 1.000ml - Hồng cầu gà 1%:
+ Máu gà trống khoẻ mạnh ñã trưởng thành, không có kháng thể cúm và Newcastle.
+ Dùng bơm tiêm loại 5 ml ñã có sẵn 1ml dung dịch chống ñông (Natri Citrat 5%) rồi lấy máu gà vào ống nghiệm.
+ Ly tâm 1500 vòng/phút, trong 15 phút, hút bỏ huyết tương, cho thêm nước sinh lý (NaCL 0,85%) vào hồng cầu, lắc ñều. Ly tâm như trên 3 - 4 lần ñể rửa hồng cầu, sau lần ly tâm cuối hút bỏ nước ở trên.
+ Pha hồng cầu thành huyễn dịch 1% bằng cách pha 1ml hồng cầu với 99 ml nước muối sinh lý.
+ Bảo quản huyễn dịch hồng cầu ở nhiệt ñộ 4 - 80C. Hồng cầu sau khi pha có thể dùng 4 - 5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết thì loại bỏ không dùng).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 43
3.3.3.2. Xử lý huyết thanh:
- Chắt huyết thanh trong seringe ra tube, ñánh dấu tube.
- Xếp các tube huyết thanh vừa chắt ñược vào khay, ñem xử lý nhiệt ở 560C/30 phút trong nồi hấp cách thuỷ hoặc tủấm 560C/15 phút ñể diệt bổ thể. - Huyết thanh sau khi ñã ñược xử lý bảo quản ở nhiệt ñộ 40C ñể dùng ngay hoặc bảo quản ở tủ - 200C ñể dùng sau.
3.3.3.3. Xác ñịnh hiệu giá của vi rút (chuẩn ñộ kháng nguyên)
Tiến hành phản ứng ngưng kết trực tiếp hồng cầu (Haemagglutinin – HA)ñể chuẩn ñộ kháng nguyên chuẩn H5 .
ðĩa làm phản ứng ngưng kết ñáy chữ V gồm 12 cột và 8 hàng (96 giếng).