Chitosan có sự tương đồng với cấu trúc của một số glycosaminoglycans (GAGs) trong các ứng dụng bên ngoài tế bào làm cho nó có thể kết dính tế bào với phản ứng cơ thể lạ ở mức tối thiểu. Tuy nhiên, vật liệu sinh học dựa trên chitosan khơng có các tính chất cơ lý phù hợp cho các ứng dụng kỹ thuật mô xương [63]. Trong số các chất tạo màng sinh học, tinh bột thường được sử dụng cho các giá đỡ kỹ thuật mơ, vì nó tương thích sinh học, có thể phân hủy sinh học, dễ tiếp cận và rẻ tiền [33]. Người ta đã nhận thấy rằng các đặc tính vật lý và hoạt tính sinh học của hydrogel chitosan được tăng lên khi trộn với tinh bột [64]. Bất chấp những cải tiến này, các cấu trúc như vậy thiếu chất dẫn
truyền xương, điều cần thiết cho quá trình tái tạo xương. Sự kết hợp của tinh bột và chitosan với hydroxyapatite trước đây đã được chứng minh là khắc phục được hạn chế này trong hoạt tính sinh học [65].
CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Hoá chất và vật liệu
2.1.1 Chitosan
Chitosan có nguồn gốc xuất xứ từ công ty Công nghệ sinh học Bio Basic Inc (Canada), chitosan với độ deacetyl >90%.
Hình 2. 1 Chitosan 100g có xuất xứ từ cơng ty Cơng nghệ sinh học Bio Basic Inc
2.1.2 Tinh bột biến tính
Tinh bột sắn (Cơng ty Tinh Bột Khoai Mì- Starch In Food, quận 2, TP.HCM) sử dụng trong bài nghiên cứu này bao gồm cả tinh bột biến tính và khơng biến tính. Quy trình biến tính như sau
Hỗn dịch gồm 400g tinh bột sắn thơ được hồ với 4 lít nước chứa 5% NaCl. Tinh bột sắn được điện phân bằng cách nhúng vào hỗn hợp hai điện cực titan (cực dương và cực âm) cách nhau 10 cm được phủ RuO2, IrO2, TiO2 để chống ăn mòn. Dịng điện xoay chiều có hiệu điện thế khoảng 5-6 V và dòng điện 3A được đặt vào huyền phù tinh bột ở 30°C trong 2 giờ và khuấy nhẹ bằng máy khuấy cơ học. Tiếp theo, HCl 1M được thêm
từ từ vào huyền phù này và pH được điều chỉnh đến 7 sau đó kiểm tra bằng giấy đo pH. Huyền phù tinh bột thu được và được rửa bằng nước cất 4 - 5 lần rồi lắng để giảm ion Cl-. Kiểm tra hàm lượng ion Cl- còn lại bằng dung dịch AgNO3 0,1M để xác nhận rằng các ion Cl- đã bị rửa trơi hồn tồn. Cuối cùng, tinh bột được sấy ở 50oC trong 10 giờ [66].
Hình 2. 2 Sơ đồ quy trình biến tính tinh bột
2.1.3 Hydroxyapatite từ xương gà
Xương gà được đưa đi rửa, xử lý để loại bỏ các tạp chất. Sau đó, xương rỗng cũng như tủy xương được loại bỏ để chỉ thu được xương đặc. Mẫu xương được rửa sạch và sau đó
ngâm trong dung dịch NaOH 0,1M 1 ngày để loại bỏ các chất béo và protein còn bám lại. Mẫu xương sau khi xử lý với xút được ngâm trong cồn 1h để loại bỏ hoàn toàn NaOH, và cuối cùng sẽ được rửa lại nhiều lần với nước.
Mẫu sau khi được xử lý loại bỏ các tạp chất và làm sạch sẽ được sấy khô ở 100 oC trong 1 ngày. Mẫu xương được sấy khô sẽ nghiền mịn và được nung ở 700 oC (tốc độ nâng nhiệt 5oC/phút) lưu trong 2h. Sản phẩm cuối cùng thu được (bột màu trắng) sẽ được bảo quản ở tủ hút ẩm [67].
Hình 2. 3 Quy trình chế tạo Hydroxyapatite từ xương gà [67]
2.2 Quy trình chế tạo giá thể
2.2.1 Quy trình chế tạo giá thể chitosan/tinh bột/HA
Trong nghiên cứu này giá thể chitosan/tinh bột được chế tạo theo phương pháp đơng tụ - sấy thăng hoa với quy trình chung được trình bày theo sơ đồ hình 2.4.
Hình 2. 4 Quy trình chế tạo giá thể chitosan/tinh bột/hydroxyapatite
Bột chitosan có khối lượng (tỷ lệ) theo bảng 2.1, được cho vào dung dịch acid acetic và khuấy trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 40-50 oC trong vòng 3 giờ, tạo dung dịch chitosan hồ tan hồn tồn. Sau đó, tinh bột biến tính có khối lượng (tỷ lệ) theo bảng 2.1 được trộn vào dung dịch và khuấy đều trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 90-100oC đến khi tất cả tinh bột chuyển sang dạng hồ tinh bột, tiếp tục khuấy hỗn hợp thêm 3 giờ hoặc 7 giờ
thể chỉ có thể khuấy ở tốc độ thấp). Gel được bơm vào xylanh và được bơm dung dịch chứa NaOH 0,25M và Na2SO4 0,375M hoặc trong dung dịch Ethanol 2M và NaOH 0,7M và được ngâm 8 giờ để tạo dạng viên đông tụ và tạo ổn định cho các viên kết tủa. Sau đó, các kết tủa chitosan-tinh bột sẽ được rửa với nước cất nhiều lần đến khi đạt được pH trung tính và loại bỏ hồn tồn lượng muối dư thừa. Các mẫu sau khi rửa sạch sẽ được đông lạnh ở nhiệt độ -40oC trước khi được sấy thăng hoa và thu thành phẩm cuối cùng. Các mẫu được bảo quản trong bình hút ẩm để tránh hư hại.
Với giá thể có hydroxyapatite, HA sẽ được siêu âm với 30ml dung dịch acid acetic 1% (v/v) trong vịng 30 phút, sau đó bột chitosan có khối lượng (tỷ lệ) theo bảng 2.1 sẽ được cho vào dung dịch acid acetic đã được phân tán HA và khuấy trên máy khuấy từ ở nhiệt độ 40-50oC trong vòng 3 giờ, tiếp theo giá thể sẽ được tiếp tục chế tạo theo quy trình giá thể khơng có HA.
2.2.2 Các khảo sát ảnh hưởng đến tính chất cơ lý của giá thể
2.2.2.1 Khảo sát tỷ lệ khối lượng thành phần chitosan/tinh bột
Bảng 2. 1 Bảng tỷ lệ khối lượng chitosan/tinh bột trong 30ml dung dịch và ký hiệu Chitosan (g) Tinh bột (g) Tổng khối lượng (g) Tỷ lệ CS/TB 0,90 0,600 1,5 6/4 0,825 0,675 1,5 5,5/4,5 0,75 0,750 1,5 5/5 0,675 0,825 1,5 4,5/5,5 0,60 0,900 1,5 4/6
Tỷ lệ tinh bột và chitosan được thay đổi theo bảng 2.1 và được khảo sát với dung dịch đông tụ là NaOH-Na2SO4 và NaOH-Ethanol với thời gian khuấy 6 giờ và 10 giờ để xác định được tỷ lệ và phù hợp dựa trên cơ tính, độ phân huỷ, độ trương và độ rỗng.
2.2.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của dung dịch đơng tụ đến tính chất cơ lý của giá thể
Tỷ lệ tinh bột và chitosan thay đổi theo bảng 2.1 với tổng thời gian khuấy 6 giờ. Sau đó, hỗn hợp chitosan/tinh bột được nhỏ từng giọt to vào 2 dung dịch tạo đông tụ khác nhau
gồm dung dich NaOH-Na2SO4 và dung dịch NaOH- Ethanol nhằm khảo sát để tạo kết tủa. Các viên kết tủa được lưu trong dung dịch này trong vòng 8 giờ. Mục tiêu của khảo sát này là nhằm lựa chọn được dung dịch để chế tạo giá thể kết tủa tốt về cơ tính, độ trương, độ rỗng, độ phân huỷ của giá thể.
Hình 2. 5 Mẫu giá thể được ngâm trong dung dịch đông tụ
2.2.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian khuấy đến tính chất cơ lý của giá thể
Tỷ lệ tinh bột và chitosan thay đổi theo bảng 2.1 được tiến hành khảo sát tổng thời gian khuấy trong vòng 6 giờ và 10 giờ, mẫu được ngâm trong dung dịch NaOH-Na2SO4 (theo kết quả khảo sát của mục 2.2.2.2) để xác định sự ảnh hưởng của thời gian khuấy đối với từng tỷ lệ và chọn ra thời gian khuấy tối ưu.
2.2.2.4 Khảo sát hàm lượng Hydroxyapatite đến tính chất cơ lý của giá thể
Qua kết quả khảo sát đánh giá mục 2.2.2.2 và 2.2.2.3 ta chọn giá thể chitosan/tinh bột có tỷ lệ 4,5/5,5 là vì giá thể này có cơ tính phù hợp cho việc thêm HA. Khi thêm HA HA cơ tính của giá thể sẽ tăng lên, các tỷ lệ giá thể chitosan/tinh bột có cơ tính cao khi thêm HA sẽ làm cho giá thể có cơ tính q cao gây ra hiện tượng giá thể bị giòn, mặt khác các giá thể có cơ tính cao sẽ có độ đặc cao ở trạng thái giá thể ướt, điều này gây ra khó khăn trong q trình khuấy để chế tạo giá thể
Qua quan điểm trên tỷ lệ chitosan/tinh bột là 4,5-5,5 để khảo sát hàm lượng HA từ 0-10% ảnh hưởng đến tính chất cơ lý của giá thể qua đó chọn ra tỷ lệ HA tối ưu.
Bảng 2. 2 Hàm lượng Hydroxyapatite theo tổng khối lượng chitosan và tinh bột Hàm lượng HA (%) 0 2,5 5 7,5 10 Khối lượng HA (g) 0 0,0375 0,075 0,1125 0,15
2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu
2.2.3.1 Phương pháp đo cơ tính của của giá thể
Độ bền cơ của giá thể được tính tốn thơng qua modul đàn hồi Young, được tính tốn thơng qua đường cong ứng suất và biến dạng được thực hiện bằng máy TexturePro CT V1.9 Build 35, sử dụng đầu đặt lực có đường kính đầu đo 6mm, tốc độ gia lực 0,02 mm/s đến 50% độ biến đang. Mẫu dùng để đo cơ tính là mẫu ướt chưa qua q trình sấy thăng hoa. Ứng suất nén σ được tính theo cơng thức sau:
𝜎 =𝐹 𝐴
Trong đó:
• 𝜎: Ứng suất nén (N/mm2) • F: Lực nén (N)
• A: Tiết diện của đầu đo tiếp xúc trực tiếp lên mẫu đo. Và được xác định theo công thức:
A(mm2) = 𝐷
2
4 × 𝜋=R2× 𝜋
Trong đó: D: Đường kính đầu đo (D=6mm) Biến dạng 𝜀 được tính theo cơng thức:
𝜀 = ∆𝐿 𝐿
Trong đó:
• 𝜀: Độ biến dạng (%)
• 𝐿: Độ dày mẫu ban đầu
2.2.3.2 Phương pháp đo độ rỗng
Độ rỗng của giá thể chitosan-tinh bột được xác định bằng phương pháp thay thế chất lỏng [68].
Mẫu có kích thước 10mmx10mmx2mm có khối lượng m1(g), bình chứa đầy hexan có khối lượng m2 (g). Giá thể được nhúng vào bình chứa đầy hexan. Sau khi loại bỏ lượng hexan dư, khối lượng cả bình, dung dịch hexan và mẫu cân có giá trị là m3 (g). Mẫu được ngâm trong vòng 5 phút. Sau đó, mẫu được lấy ra và cân lại khối lượng bình + hexan có giá trị là m4 (g). Độ rỗng (P) của giá thể được tính theo cơng thức:
𝑃% = (m3 − 𝑚4 − 𝑚1)/(𝑚2 − 𝑚4)
Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
• m2: Khối lượng bình chứa đầy hexan (g) • m3: Khối lượng cả bình, hexan và mẫu (g)
• m4: Khối lượng bình và hexan sau khi lấy mẫu ra (g)
2.2.3.3 Phương pháp đo độ trương
Độ trương (S) của giá thể được xác định theo phương pháp xác định khối lượng thay đổi [69]. Mẫu khơ ban đầu có khối lượng m1 (g) được ngâm trong nước cất ở 37oC trong vòng 24 giờ và 48 giờ. Sau đó, mẫu được vớt ra thấm hết nước dư thừa rồi cân khối lượng có giá trị m2(g). Độ trương nở của giá thể được tính theo cơng thức sau:
S(%)= 𝑚2−𝑚1 𝑚1 x100 Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu khơ ban đầu (g) • m2: Khối lượng mẫu ướt sau khi ngâm (g)
2.2.3.4 Phương pháp xác định độ phân huỷ
Độ phân huỷ (D) của giá thể sau khi sấy thăng hoa được xác định theo phương pháp xác định sự thay đổi khối lượng mẫu theo thời gian ngâm trong dung dịch [69]. Mẫu có kích thước 10mmx10mmx2mm được cân xác định khối lượng m1 (g). Mẫu được ngâm trong 15ml dung dịch muối đệm photphat (PBS) ở 37oC trong 7 ngày và 14 ngày. Dung dịch đệm PBS được thay mới ba ngày một lần. Sau đó, mẫu được lấy ra rửa sạch vài lần bằng nước cất và được sấy thăng hoa, cân và xác định khối lượng m2. Độ phân huỷ được xác định theo cơng thức sau:
D (%) =𝑚2−𝑚1 𝑚1 x100 Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu khơ ban đầu (g)
• m2: Khối lượng mẫu khô sau khi ngâm phân rã và đã được sấy thăng hoa (g)
2.2.3.5 Phương pháp xác định lượng Ca2+ được giải phóng
Hình 2. 6 Thiết bị sắc ký ion AS-DV
Xác định hàm lượng Ca2+ giải phóng ra khỏi giá thể nhằm dự đoán khả năng tạo xương mới của giá thể.
Mẫu dạng viên hạt đã sấy thăng hoa có đường kính 5mm sẽ được ngâm trong dung dịch muối đệm photphat (PBS) ở 37oC trong 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Phần nước sau khi
ngâm mẫu giá thể chitosan/tinh bột/hydroxyapatite sẽ được lọc bằng đầu lọc có kích thước lỗ bằng 0,22µm và cho vào virals để tiến hành đo hàm lượng Ca2+ giải phóng ra khỏi giá thể. Phương pháp đo thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký ion IC là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động trên thiết bị sắc ký ion AS-DV trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM.
2.2.3.6 Kính hiển vi điện tử SEM và phổ tán xạ năng lượng EDS
Hình 2. 7 Thiết bị đo SEM TM4000Plus
Kính hiển vi điện tử SEM được sử dụng để xác định hình thái, cấu trúc của Hydroxyapatite tổng hợp từ xương gà và hình thái cấu trúc (kích thước lỗ rỗng, cấu tạo sự phân bố của lỗ rỗng) của giá thể chitosan-tinh bột, sự phân bố của HA trên bề mặt và bên trong giá thể.
Mẫu dùng để phân tích SEM kích thước 10 mm x 10 mm, được phủ bằng hợp kim Pt/Pd trước khi quét bằng TM4000PLUS của Hitachi tại trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM sử dụng tia BSE. Ngoài ra trong TM4000PLUS được kết hợp EDS (Energy Dispersive X-Ray Spectrometer) – Bruker dùng để xác định sự có mặt và phân bố của HA trên bề mặt và bên trong giá thể.
2.2.3.7 Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại (FTIR)
Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) là phương pháp được ứng dụng để phân tích cấu trúc hố học của vật liệu, bằng cách kiểm tra các liên kết hoá học và thành phần dựa vào các peak đặc trưng của nhóm chức.
Mẫu bột HA từ xương gà và mẫu giá thể có tỉ lệ 4,5/5,5 có hàm lượng HA theo bảng 2.2 sau khi được sấy thăng hoa sẽ được được chuẩn bị với kích thước 0,5x0,5x0,5 (cm) sẽ được đặt vào buồng chứa mẫu trên thiết bị Jabco FT IR 4700 (Nhật) tại trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM có vùng phổ có vùng số sóng từ 4000 – 400 cm-1 giúp xác định các nhóm chức đặc trưng của mẫu HA từ xương gà và các giá thể có HA đã được sấy thăng hoa. Mẫu trắng là khơng khí được đo cùng điều kiện như trên. Phổ thu được sau khi đã trừ phổ của mẫu trắng, CO2 của khơng khí và hơi ẩm.
Hình 2. 8 Ảnh thiết bị đo FTIR JABCO FTIR 4700
2.2.3.8 Phương pháp phân tích phổ nhiễu xạ tia X
Phương pháp này được sử dụng để khảo sát cấu trúc pha của tinh bột, chitosan, HA và giá thể composite bằng thiết bị nhiễu xạ tia X (XRD phân tích cấu trúc) loại Empyrean hãng Malvern Panalytical (Vương Quốc Anh) với bức xạ Kα1= 1.5406 của Cu là λα = 1.5418 Å, góc quét 2𝜃 = 0 – 80oC trường Đại học Tài chính – Marketing.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả giá thể composite chitosan - tinh bột
3.1.1 Hình ảnh cảm quan của giá thể
A: giá thể chitosan/tinh bột tỷ lệ 4,5/5,5 trước khi sấy thăng hoa
B: giá thể chitosan/tinh bột tỷ lệ 4,5/5,5 sau khi sấy thăng hoa
Hình 3. 1 Hình ảnh giá thể chitosan/tinh bột trước và sau khi sấy thăng hoa Giá thể chitosan-tinh bột có màu vàng nhạt và một số điểm trắng trên bề mặt có thể do Giá thể chitosan-tinh bột có màu vàng nhạt và một số điểm trắng trên bề mặt có thể do lượng tinh bột chưa phản ứng hết hoàn toàn với chitosan được lôi cuốn theo nước ra bên ngồi trong q trình sấy thăng hoa, giá thể khá cứng và giịn, có mật độ độ rỗng lớn và dễ hấp thụ nước. Giá thể trước khi sấy thăng hoa có kích thước lớn hơn so với giá thể sau sấy, mẫu có độ đàn hồi kém.
Đánh giá cảm quan 2 giá thể được sử dụng 2 dung dịch đông tụ khác nhau cho thấy cả 2 giá thể đều có cấu trúc rỗng và độ rỗng giá thể rất lớn. Trong cấu trúc rỗng, vẫn có xuất hiện sự liên thông giữa các lỗ. Về mặt khác nhau, giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa Ethanol có màu vàng nhạt, ít xuất hiện đốm trắng của tinh bột trên bề mặt và mềm hơn, cơ tính thấp hơn giá thể đơng tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42-.
A: mặt cắt của giá thể B: Bề mặt của giá thể
Hình 3. 3 Hình ảnh phân tích SEM của giá thể chitosan/tinh bột: A: mặt cắt của giá thể; B: bề mặt của giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion sulfate