2.2 Quy trình chế tạo giá thể
2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu
2.2.3.1 Phương pháp đo cơ tính của của giá thể
Độ bền cơ của giá thể được tính tốn thơng qua modul đàn hồi Young, được tính tốn thơng qua đường cong ứng suất và biến dạng được thực hiện bằng máy TexturePro CT V1.9 Build 35, sử dụng đầu đặt lực có đường kính đầu đo 6mm, tốc độ gia lực 0,02 mm/s đến 50% độ biến đang. Mẫu dùng để đo cơ tính là mẫu ướt chưa qua q trình sấy thăng hoa. Ứng suất nén σ được tính theo cơng thức sau:
=
Trong đó:
• : Ứng suất nén (N/mm2) • F: Lực nén (N)
• A: Tiết diện của đầu đo tiếp xúc trực tiếp lên mẫu đo. Và được xác định theo công thức:
2
A(mm2) = × =R2×
Trong đó: D: Đường kính đầu đo (D=6mm) Biến dạng được tính theo cơng thức:
∆
=
Trong đó:
• : Độ biến dạng (%)
• ∆ : Độ biến dạng bề dày của mẫu vật liệu khi bắt đầu nén (mm)
• : Độ dày mẫu ban đầu
2.2.3.2 Phương pháp đo độ rỗng
Độ rỗng của giá thể chitosan-tinh bột được xác định bằng phương pháp thay thế chất lỏng [68].
Mẫu có kích thước 10mmx10mmx2mm có khối lượng m1(g), bình chứa đầy hexan có khối lượng m2 (g). Giá thể được nhúng vào bình chứa đầy hexan. Sau khi loại bỏ lượng hexan dư, khối lượng cả bình, dung dịch hexan và mẫu cân có giá trị là m3 (g). Mẫu được ngâm trong vịng 5 phút. Sau đó, mẫu được lấy ra và cân lại khối lượng bình + hexan có giá trị là m4 (g). Độ rỗng (P) của giá thể được tính theo cơng thức:
% = (m3 − 4 − 1)/( 2 − 4)
Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu ban đầu (g)
• m2: Khối lượng bình chứa đầy hexan (g) • m3: Khối lượng cả bình, hexan và mẫu (g)
• m4: Khối lượng bình và hexan sau khi lấy mẫu ra (g)
2.2.3.3 Phương pháp đo độ trương
Độ trương (S) của giá thể được xác định theo phương pháp xác định khối lượng thay đổi [69]. Mẫu khơ ban đầu có khối lượng m1 (g) được ngâm trong nước cất ở 37oC trong vịng 24 giờ và 48 giờ. Sau đó, mẫu được vớt ra thấm hết nước dư thừa rồi cân khối lượng có giá trị m2(g). Độ trương nở của giá thể được tính theo cơng thức sau:
S(%)= 2− 1 1x100
Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu khơ ban đầu (g) • m2: Khối lượng mẫu ướt sau khi ngâm (g)
2.2.3.4 Phương pháp xác định độ phân huỷ
Độ phân huỷ (D) của giá thể sau khi sấy thăng hoa được xác định theo phương pháp xác định sự thay đổi khối lượng mẫu theo thời gian ngâm trong dung dịch [69]. Mẫu có kích thước 10mmx10mmx2mm được cân xác định khối lượng m1 (g). Mẫu được ngâm trong 15ml dung dịch muối đệm photphat (PBS) ở 37oC trong 7 ngày và 14 ngày. Dung dịch đệm PBS được thay mới ba ngày một lần. Sau đó, mẫu được lấy ra rửa sạch vài lần bằng nước cất và được sấy thăng hoa, cân và xác định khối lượng m2. Độ phân huỷ được xác định theo công thức sau:
D (%) = 2− 1 1x100
Trong đó:
• m1: Khối lượng mẫu khơ ban đầu (g)
• m2: Khối lượng mẫu khơ sau khi ngâm phân rã và đã được sấy thăng hoa (g)
2.2.3.5 Phương pháp xác định lượng Ca2+ được giải phóng
Hình 2. 6 Thiết bị sắc ký ion AS-DV
Xác định hàm lượng Ca2+ giải phóng ra khỏi giá thể nhằm dự đốn khả năng tạo xương mới của giá thể.
Mẫu dạng viên hạt đã sấy thăng hoa có đường kính 5mm sẽ được ngâm trong dung dịch muối đệm photphat (PBS) ở 37oC trong 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày. Phần nước sau khi
ngâm mẫu giá thể chitosan/tinh bột/hydroxyapatite sẽ được lọc bằng đầu lọc có kích thước lỗ bằng 0,22µm và cho vào virals để tiến hành đo hàm lượng Ca2+ giải phóng ra khỏi giá thể. Phương pháp đo thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống sắc ký ion IC là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động trên thiết bị sắc ký ion AS-DV trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM.
2.2.3.6 Kính hiển vi điện tử SEM và phổ tán xạ năng lượng EDS
Hình 2. 7 Thiết bị đo SEM TM4000Plus
Kính hiển vi điện tử SEM được sử dụng để xác định hình thái, cấu trúc của Hydroxyapatite tổng hợp từ xương gà và hình thái cấu trúc (kích thước lỗ rỗng, cấu tạo sự phân bố của lỗ rỗng) của giá thể chitosan-tinh bột, sự phân bố của HA trên bề mặt và bên trong giá thể.
Mẫu dùng để phân tích SEM kích thước 10 mm x 10 mm, được phủ bằng hợp kim Pt/Pd trước khi quét bằng TM4000PLUS của Hitachi tại trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM sử dụng tia BSE. Ngoài ra trong TM4000PLUS được kết hợp EDS (Energy Dispersive X-Ray Spectrometer) – Bruker dùng để xác định sự có mặt và phân bố của HA trên bề mặt và bên trong giá thể.
2.2.3.7 Phương pháp phân tích bằng phổ hồng ngoại (FTIR)
Quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) là phương pháp được ứng dụng để phân tích cấu trúc hố học của vật liệu, bằng cách kiểm tra các liên kết hoá học và thành phần dựa vào các peak đặc trưng của nhóm chức.
Mẫu bột HA từ xương gà và mẫu giá thể có tỉ lệ 4,5/5,5 có hàm lượng HA theo bảng 2.2 sau khi được sấy thăng hoa sẽ được được chuẩn bị với kích thước 0,5x0,5x0,5 (cm) sẽ được đặt vào buồng chứa mẫu trên thiết bị Jabco FT IR 4700 (Nhật) tại trường Đại học Sư Phạm Kỹ Thuật TPHCM có vùng phổ có vùng số sóng từ 4000 – 400 cm-1 giúp xác định các nhóm chức đặc trưng của mẫu HA từ xương gà và các giá thể có HA đã được sấy thăng hoa. Mẫu trắng là khơng khí được đo cùng điều kiện như trên. Phổ thu được sau khi đã trừ phổ của mẫu trắng, CO2 của khơng khí và hơi ẩm.
Hình 2. 8 Ảnh thiết bị đo FTIR JABCO FTIR 4700 2.2.3.8 Phương pháp phân tích phổ nhiễu xạ tia X 4700 2.2.3.8 Phương pháp phân tích phổ nhiễu xạ tia X
Phương pháp này được sử dụng để khảo sát cấu trúc pha của tinh bột, chitosan, HA và giá thể composite bằng thiết bị nhiễu xạ tia X (XRD phân tích cấu trúc) loại Empyrean hãng Malvern Panalytical (Vương Quốc Anh) với bức xạ Kα1= 1.5406 của Cu là λα = 1.5418 Å, góc quét 2 = 0 – 80oC trường Đại học Tài chính – Marketing.
Hình 2. 9 Ảnh thiết bị đo XRD
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN