3.1.1 Hình ảnh cảm quan của giá thể
A: giá thể chitosan/tinh bột tỷ lệ 4,5/5,5 B: giá thể chitosan/tinh bột tỷ lệ 4,5/5,5 trước khi sấy thăng hoa sau khi sấy thăng hoa
Hình 3. 1 Hình ảnh giá thể chitosan/tinh bột trước và sau khi sấy thăng hoa
Giá thể chitosan-tinh bột có màu vàng nhạt và một số điểm trắng trên bề mặt có thể do lượng tinh bột chưa phản ứng hết hoàn tồn với chitosan được lơi cuốn theo nước ra bên ngồi trong q trình sấy thăng hoa, giá thể khá cứng và giịn, có mật độ độ rỗng lớn và dễ hấp thụ nước. Giá thể trước khi sấy thăng hoa có kích thước lớn hơn so với giá thể sau sấy, mẫu có độ đàn hồi kém.
A: NaOH-EtOH B: NaOH-Na2SO4
Hình 3. 2 Hình ảnh giá thể chitosan/tinh bột A. giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa EtOH và giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa SO42-
Đánh giá cảm quan 2 giá thể được sử dụng 2 dung dịch đông tụ khác nhau cho thấy cả 2 giá thể đều có cấu trúc rỗng và độ rỗng giá thể rất lớn. Trong cấu trúc rỗng, vẫn có xuất hiện sự liên thông giữa các lỗ. Về mặt khác nhau, giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa Ethanol có màu vàng nhạt, ít xuất hiện đốm trắng của tinh bột trên bề mặt và mềm hơn, cơ tính thấp hơn giá thể đông tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42-
.
A: mặt cắt của giá thể B: Bề mặt của giá thể
Hình 3. 3 Hình ảnh phân tích SEM của giá thể chitosan/tinh bột: A: mặt cắt của giá thể; B: bề mặt của giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion sulfate
Kết quả phân tích SEM cho thấy giá thể được tạo ra có được mật độ rỗng ở trên bề mặt lẫn bên trong của giá thể.
3.1.2 Ảnh hưởng của dung dịch đơng tụ đến tính chất cơ lý của giá thể
Các tính chất vật lý của giá thể được thiết kế mơ phỏng một cách lý tưởng các tính năng của chất nền ngoại bào tự nhiên để điều chỉnh chức năng tế bào. Do đó, việc kiểm sốt các đặc tính vật lý của giá thể như modulus đàn hồi và độ rỗng là những bước đầu tiên cho quá trình ứng dụng của giá thể trong các nghiên cứu sâu hơn.
3.1.2.1 Cơ tính
Dung dịch đơng tụ được sử dụng để ngâm giá thể trước khi sấy ảnh hưởng đến tính chất cơ của giá thể được thể hiện ở hình 3.4. Nhìn chung giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42- có Young modulus cao hơn so với giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa EtOH. Tuy nhiên có một ngoại lệ nằm ở tỷ lệ 6-4, giá thể được ngâm dung dịch NaOH- EtOH có modulus 125,3 KPa cao hơn giá thể được ngâm trong NaOH-Na2SO4
105,3 KPa. Giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42- có tỷ lệ 5/5 có cơ tính cao nhất với modulus đàn hồi đạt giá trị 171,1 KPa. Giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa EtOH có tỷ lệ 4,5/5,5 có cơ tính thấp nhất với 60,7 KPa. Theo nghiên cứu của East and Qin [70], những sợi chitosan được tạo ra từ phương pháp đông tụ-thăng hoa sử dụng dung dịch đơng tụ có NaOH-Na2SO4 có được modulus tốt nhất, East and Qin cũng giải thích rằng khi sợi chitosan được ngâm trong dung dịch NaOH-Na2SO4 có sự gia tăng lực liên kết tăng mức độ kết tinh so với chitosan đơng tụ trong các dung dịch khác.
Hình 3. 4 Cơ tính của giá thể theo các tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau trong các dung dịch đông tụ
3.1.2.2 Độ rỗng
Cấu trúc lỗ của chất nền ngoại bào (ví dụ, độ rỗng, khả năng liên kết giữa các lỗ và kích thước lỗ) ảnh hưởng đáng kể đến mức độ khuếch tán chất dinh dưỡng và oxy đối với sự tồn tại của tế bào cũng như loại bỏ chất thải trao đổi chất. Các nghiên cứu cho thấy các giá thể có độ rỗng khoảng 88% giúp cho sự phát triển mô xương tốt hơn [71]. Trong phương pháp đông tụ - sấy thăng hoa lỗ rỗng phụ thuộc vào tỷ lệ rắn/lỏng, và giai đoạn “hy sinh” của tinh bột tức là lượng tinh bột chưa phản ứng sẽ theo hơi nước trong quá trình sấy tạo thêm lỗ rỗng cho giá thể. Độ rỗng của giá thể được thể hiện ở hình 3.5. Tất cả các giá thể ở các tỉ lệ… được đông tụ trong mơi trường kiềm chứa sulfate hay
ethanol đều có độ rỗng cao, từ 85,5%-89,9%. Đây là độ rỗng phù hợp trong ứng dụng thay thế mơ xương [71]. Khơng có sự chênh lệch độ rỗng nhiều giữa giá thể tạo từ 2 dung dịch khác nhau, độ chênh lệch về độ rỗng không đáng kể chỉ từ 2-3%. Tuy nhiên độ rỗng quá cao sẽ dẫn đến cơ tính của giá thể sẽ giảm, điều này được thể hiện ở giá thể EtOH theo hình 3.5 và 3.4. Do đó, phương pháp tạo giá thể bằng dung dịch đông tụ đã thoả mãn độ rỗng lý tưởng cho giá thể.
Hình 3. 5 Độ rỗng của giá thể theo các tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau trong các dung dịch đơng tụ
3.1.2.3 Độ trương
Tính chất trương nở của giá thể rất quan trọng đối với sự trao đổi dinh dưỡng và chất thải trong cơ thể vì nó thể hiện khả năng trao đổi chất của giá thể với mơi trường ngồi.
Kết quả khảo sát độ trương của giá thể trong hai dung dịch đơng tụ được trình bày ở hình 3.6. Kết quả cho thấy độ trương của giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa Ethanol cao hơn rất nhiều so với SO4. Độ trương trong 48 giờ cao hơn trong 24 giờ. Trong 24 giờ giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa Ethanol 4/6 có độ trương cao nhất với 181,2% và thấp nhất ở giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa SO42- 5/5 với 78%, trong 48 giờ cũng ghi nhận giá thể được ngâm trong NaOH-EtOH 4/6 có độ trương cao nhất 184,9% và thấp nhất ở giá thể được ngâm trong NaOH-Na2SO4 5/5. Khi tăng thời gian ngâm trong nước cất thì độ trương các giá thể tăng lên do các gốc ưa nước trong giá thể tiếp tục liên kết với H2O. Mặt khác, giá thể đông tụ bởi dung dịch kiềm chứa
sulfate, các phân tử sắp xếp lại chặt chẽ hơn, nghĩa là mức độ tinh thể hóa lại của chitosan cao hơn cho nên làm cho các phân tử nước khó tiếp xúc hơn với pha rắn của giá thể nên dẫn đến độ trương trong dung dịch sulfate thấp hơn và modul Young cao hơn [70].
Hình 3. 6 Độ trương của giá thể theo các tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau trong các dung dịch đông tụ được ngâm trong nước cất 24h và 48h.
3.1.2.4 Độ phân huỷ
Mức độ phân huỷ của giá thể là một trong những đặc điểm quan trọng nhất trong việc lựa chọn và thiết kế vật liệu giá thể, độ phân huỷ đảm bảo đủ thời gian trong việc tái tạo tế bào xương. Độ phân huỷ của các tỷ lệ trong hai dung dịch đông tụ trong 7 và 14 ngày. Kết quả khảo sát mức độ phân huỷ của giá thể được trình bày ở hình 3.7 cho thấy: mức độ phân huỷ của tất cả giá thể ở 14 ngày cao hơn mức độ phân hủy của các giá thể ở 7 ngày. Ở thời gian 7 ngày, khả năng phân hủy của giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa EtOH có xu hướng cao hơn giá thể được ngâm trong NaOH-Na2SO4 ngoại trừ tỷ lệ 4,5/5,5, tuy nhiên sự chênh lệch không nhiều, và ghi nhận giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa EtOH 6/4 có độ phân huỷ cao nhất với 20,93%.
Ở thời gian 14 ngày, mức độ phân huỷ của giá thể kết tụ trong trong dung dịch kiềm chứa EtOH cao hơn giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42- ngoại trừ giá thể được ngâm trong dung dịch NaOH-EtOH tỷ lệ 4,5/5,5 và 4/6. Giá thể được ngâm trong dung dịch kết tụ trong dung dịch kiềm chứa ion SO42- với 26,93%. Độ phân huỷ của giá thể chủ yếu là do sự đứt gãy của các chuỗi polymer. Do giá thể kết tụ trong dung dịch
kiềm chứa EtOH có độ trương cao hơn giá thể được ngâm trong NaOH-Na2SO4 nên các gốc ưa nước của giá thể được ngâm trong dung dịch kiềm chứa EtOH tiếp tục phản ứng với nước làm cho các chuỗi dễ đứt gãy hơn.
Hình 3. 7 Độ phân huỷ của giá thể theo các tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau trong các dung dịch đông tụ được ngâm trong dung dịch đệm PBS 7 ngày và 14 ngày.
3.1.3 Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến tính chất cơ lý của giá thể
Thời gian khuấy càng tăng lên giúp cho hiệu suất phản ứng giữa, chitosan và chitosan, chitosan và tinh bột tăng lên, góp phần làm tăng cơ lý tính của giá thể [43].
Hình 3. 8 Phản ứng giữa chitosan với tinh bột tạo các nối ngang [72].
3.1.3.1 Cơ tính
Ảnh hưởng của thời gian khuấy đến cơ tính của giá thể đơng tụ trong mơi trường sulfate được trình bày ở hình 3.9. Hình 3.9 cho thấy Young modulus của giá thể sau khi tăng thời gian khuấy. Điều này có thể do hiệu suất phản ứng cao làm cho gốc OH của tinh bột và gốc NH2 của chitosan phản ứng tốt hơn [72], dẫn đến tăng độ cứng của giá thể.
Với thời gian khuấy 10 giờ, cơ tính của giá thể giảm dần theo hàm lượng chitosan và giá thể 6/4 có modulus cao nhất với 220,5 KPa và giảm dần theo tỷ lệ tới 134 KPa ở tỷ lệ 4/6. Với thời gian khuấy 6 giờ thì giá thể 5/5 có cơ tính cao nhất với 171,1 KPa và giá thể 4/6 có cơ tính thấp nhất với 99,28 KPa. East and Qin cũng giải thích rằng khi sợi chitosan được ngâm trong dung dịch NaOH-Na2SO4 có sự gia tăng lực liên kết và sự gia tăng mức độ kết tinh [70]. Khi tăng thời gian khuấy, hiệu suất phản ứng giữa NH2 của chitosan và nhóm OH- của tinh bột giúp tăng các liên kết ngang và modulus trong vật liệu [72].
Hình 3. 9 Cơ tính của các giá thể với tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau với các thời gian khuấy khác nhau
3.1.3.2 Độ rỗng
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian khuấy đến độ rỗng của giá thể được trình bày ở hình 3.10. Trên hình 3.10, cho thấy độ rỗng của giá thể được khuấy 6 giờ có xu hướng cao hơn giá thể được tạo hình khi khuấy 10 giờ ở mọi tỷ lệ. Độ rỗng cao nhất ở giá thể (10 giờ) nằm ở tỷ lệ 4/6 với 84,95 % và thấp nhất ở tỷ lệ 5/5 với 80,48%. Do mật độ liên kết giữa tinh bột và chitosan chặt chẽ hơn bằng chứng là giá thể (10 giờ) có Young mudulus cao hơn (như phần kết quả hình 3.9) giá thể (6 giờ) nên độ rỗng của giá thể (10 giờ) thấp hơn. Thông thường các giá thể dùng cho mô xương thường thiết kế với độ rỗng >80%. Nên, nhìn chung giá thể được khuấy trong vịng 6 giờ mang có giá trị độ
rỗng phù hợp hơn cho tiêu chí tạo giá thể mơ xương hơn giá thể có cùng thành phần được khuấy trong 10h
Hình 3. 10 Độ rỗng của các giá thể với tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau với các thời gian khuấy khác nhau
3.1.3.3 Độ trương
Hình 3. 11 Độ trương của các giá thể với tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau sau khi ngâm trong nước cất 24h và 48h với các thời gian khuấy khác nhau
Kết quả khảo sát độ trương do ảnh hưởng của thời gian khuấy đến giá thể được trình bày ở hình 3.11 cho thấy độ trương giá thể được khuấy 10 giờ thấp hơn giá thể được khuấy 6 giờ, tỷ lệ giá thể (10 giờ) có độ trương cao nhất là 6/4 với 67,61% trong 24 giờ và tỷ lệ 4/6 với 84,56 % trong 48 giờ. Điều này là do khi tăng thời gian khuấy làm tăng hiệu suất phản ứng giữa các chuỗi polymer làm giảm hàm lượng các gốc NH2 và OH-
[72] dẫn đến làm giảm các gốc ưa nước như OH-, NH2 trong giá thể, cũng như làm độ rỗng của giá thể. Vì vậy, giá trị độ trương của giá thể được tạo hình sau khuấy 10 giờ nhỏ hơn độ trương của giá thể sau khuấy 6 giờ
3.1.3.4 Độ phân huỷ
Kết quả khảo sát độ phân huỷ do ảnh hưởng của thời gian khuấy đến giá thể được trình bày ở hình 3.12 cho thấy giá thể được khuấy trong vòng 10 giờ có độ phân huỷ thấp hơn ở cả hai mốc thời gian khảo sát độ phân huỷ là 7 ngày và 14 ngày. Ngồi trừ tỷ lệ 5/5 có độ phân huỷ ở giá thể (10 giờ) thấp hơn giá thể (6 giờ). Điều này là do khi tăng thời gian khuấy hàm lượng chitosan phản ứng tạo nối ngang vơi tinh bột nhiều hơn dẫn đến cấu trúc giá thể ổn định và các chuỗi chitosan ít bị thuỷ phân hơn.
Hình 3. 12 Độ phân huỷ của các giá thể với tỷ lệ chitosan/tinh bột khác nhau sau khi ngâm dung dịch đệm 7 ngày và 14 ngày với các thời gian khuấy khác nhau
3.1.4 Kết quả khảo sát hàm lượng Hydroxyapatite đến tính chất cơ lý của giá thể
Kết quả khảo sát cơ tính hàm lượng HA ảnh hưởng đến cơ tính của giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa sulfate khuấy 6 giờ có tỷ lệ 4,5/5,5 được trình bày ở hình 3.13. Việc lựa chọn giá thể được ngâm trong dung dịch kiềm chứa sulftae tỷ lệ 4,5/5,5 là do giá thể này có Young mudulus 111,7 KPa và có độ phân huỷ cao sẽ phù hợp khi được cho thêm chất gia cường HA, giá thể sẽ không bị quá cứng, mật độ giữa HA và giá thể kết tụ trong dung dịch kiềm chứa sulfate tỷ lệ 4,5/5,5 cũng không đáng kể đảm bảo độ rỗng của giá thể. Khi tăng hàm lượng HA từ 2,5%-7,5% thì modulus của giá thể cũng tăng lên từ 151,39 KPa đến 161,88 KPa và giảm khi tăng hàm lượng HA 10% 153,91 KPa. Modulus của giá thể được ghi nhận cao nhất khi thêm 7,5% HA và thấp nhất khi thêm 5 % HA. Khi có mặt HA trong giá thể, HA đóng vai trị như vật liệu gia cường kết hợp với chất nền chitosan tinh bột giúp tăng cơ tính cho giá thể. Tuy nhiên, hàm lượng HA được thêm vào không đồng đều với lượng chất nền sẽ gây ra hiện tượng phân bố không đều và hệ quả là sự kết tụ của các hạt HA trong giá thể, điều này có thể làm cho giá thể bị giảm cơ tính.
Hình 3. 13 Kết quả khảo sát hàm lượng HA ảnh hưởng đến cơ tính của giá thể
3.1.4.1 Kết quả hàm lượng Ca2+ giải phóng theo thời gian
Hàm lượng Ca2+ ở các tỷ lệ HA 2,5%, 5%, 7,5%,10% giải phóng theo thời gian được trình bày ở hình 3.14 cho thấy hàm lượng hydroxyapatite phân tán trong mẫu càng lớn
hàm lượng Ca2+ giải phóng càng cao. Trong 7 ngày đầu, hàm lượng canxi giải phóng ở các tỷ lệ HA gần bằng với nhau là do trong 7 ngày đầu tiên độ phân huỷ của giá thể chưa đáng kể nên Canxi phân rã chủ yếu nhờ vào hàm lượng HA trên bề mặt, trong 14 và 21 ngày sau đó, tỷ lệ %HA càng cao hàm lượng Ca2+ giải phóng càng nhiều do độ phân huỷ càng lớn hàm lượng HA được phân tán trong giá thể được giải phóng, do đó khi ngâm mẫu càng lâu hàm lượng canxi giải phóng càng lớn.
Hình 3. 14 Hàm lượng Ca2+ ở các tỷ lệ HA (%) giải phóng theo thời