3.3.2.1. Chiết tách DNA
− DNA ựược phân lập từ lá non của cây con 30 ngày tuổi bằng phương pháp CTAB ựược mô tả bởi (Doyle và Doyle, 1990) với một số cải tiến nhỏ.
− Quy trình chiết xuất DNA: cắt khoảng 100 mg mô lá non vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 350 ộl ựệm chiết (2% CTAB (w/v), 1,5M NaCl, 100mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β - Mercaptoethanol), tiếp tục thêm 350 ộl ựệm chiết và trộn ựều trước khi chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm 1,5ml. Ủ mẫu ở 65ỨC trong 1 giờ sau ựó bổ sung 700ộl hỗn hợp 25:24:1 (25 Phenol : 24 Chloroform : 1 isoamyl alcohol) và trộn nhẹ nhàng bằng cách ựảo ngược các ống trong 5 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng với tốc ựộ 12000 rpm ựể phân tách các pha, hút dịch lỏng phắa trên sang một ống ly tâm 1,5ml mớị Tiếp tục thêm cùng thể tắch hỗn hợp 24:1 (24 Chloroform : 1 isoamyl alcohol), ựảo trộn nhẹ nhàng trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng (12000 rpm), chuyển dịch lỏng phắa trên sang 1 ống ly tâm mớị Tủa DNA với 2 - 2,5 lần thể tắch ethanol lạnh 100%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì ựặt mẫu ở - 20oC trong khoảng 20 phút ựến 2 tiếng hoặc qua ựêm. Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút, tốc ựộ 12000 rpm. đổ bỏ cồn, rửa tủa hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB. Làm khô tủa trong không khắ khoảng 1 tiếng và hòa tan trong 50ộl ựệm TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0). Kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA bằng ựiện di trên gel agarose 1% ở hiệu ựiện thế
100V trong khoảng 15 phút. độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức ựộ ựứt gãy và nồng ựộ DNA tổng số.
3.3.2.2. Chạy PCR ựánh giá ựa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
− Mồi SSR: sử dụng 10 cặp mồi SSR. Tên, trình tự và nhiệt ựộ gắn mồi ựược trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Trình tự và nhiệt ựộ gắn mồi các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ựa dạng di truyền các mẫu giống cà chua nghiên cứu
STT Tên mồi Trình tự mồi Ta (oC) Tham khảo
F: 5'-tcc tcc ggt tgt tac tcc ac 1 SSR-304
R: 5'-tta gca ctt cca ccg att cc 49 F: 5'-tgt gtt gga tgt ttg gca ct
2 SSR-108
R: 5'-gcc att gaa act tgc aga ga 48.5
Parmar và cộng sự (2010)
F: 5'-aag aaa ctt ttt gaa tgt tgc 3 Tom 49-50
R: 5'-att aca att tag aga gtc aag g 43 F: 5'-gca ttg att gaa ctt cat tct cgt cc 4 Tom 8-9 A
R: 5'-att ttt gtc cac caa cta acc g 49 F: 5'-ggt gaa aag agc aaa ata gt
5 Tom 322-323
R: 5'-ttt gta atc cat gtc tat aa 38 F: 5'-gaaatctgttgaagccctctc 6 Tom 41-42 R: 5'-gactgtgatagtaagaatgag 48 F: 5'-ggcaaagaaggacccagagc 7 Tom 61-62 R: 5'-ggtgcct aaaaaagttaaat 48 F: 5'-cggactcccagaccctcat 8 Tom 69-70 R: 5'-accaatgatactactaccacaac 48 F: 5'-tggtcaccttcaacttttatac 9 Tom 202-203 R: 5'-aaatgataatgaaat ggagtga 45 F: 5'-ttctttattttggaggta 10 Tom 300-301 R: 5'-atcacaaattcaaatcac 45 Meng và cộng sự (2010) Chú thắch: Ta - nhiệt ựộ gắn mồi − Thành phần phản ứng PCR: thể tắch mỗi phản ứng là 25ộl, gồm: 0,2ộl (25mM) hỗn hợp 4 loại dNTP, 5ộl 5x buffer, 3ộl MgCl2 nồng ựộ 25mM, 0,1ộl
Taq DNA polymerase, 1,25ộl mỗi mồi SSR (nồng ựộ mồi 10ộM), 1-2ộl DNA khuôn, thêm nước cất ựến 25ộl.
− Chu kỳ nhiệt: 95oC/3 phút, 35 chu kỳ (95oC/30s, TaoC/100s, và 72oC/2 phút), kết thúc phản ứng bằng bước kéo dài ở 72oC/10 phút (với Ta là nhiệt ựộ gắn mồi, xem bảng 3.3). Sản phẩm PCR ựược ựiện di trên gel agarose 2% (w/v) trong ựệm TAE 1X, hiệu ựiện thế 5V/cm, sau ựó nhuộm ethidium bromide và chụp hình trong buồng UV.
− Phân tắch dữ liệu: sự vắng mặt hay có mặt của các vạch băng trên các mẫu giống ựược ghi lại trong một ma trận nhị phân tương ứng là 0 hoặc 1. Sự tương ựồng về di truyền giữa các mẫu giống ựược tắnh toán bằng cách sử dụng hệ số tương ựồng (Sij) ựược mô tả bởi (Nei và Li (1979)):
Trong ựó: Nij là số vạch băng chung của giống thứ i và j; Nivà Nj là số vạch băng tương ứng ở mẫu giống thứ i và j.
Dữ liệu ựược sử dụng ựể xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp ghép cặp chuỗi dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng UPGMA (Unwaited Pair Group Method using Arithmetic Averages) trên phần mềm NTSYSpc Version 2.1 (Rohlf, 2000).