Ờ Các nghiên cứu ựược thực hiện tại phòng nghiên cứu bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học Ứng dụng và Trung tâm bảo tồn và Phát triển nguồn gen Cây trồng, Trường đại học nông nghiệp HàNộị
Ờ Thời gian thực hiện: từ tháng 1/2013 ựến 8/2013.
3.2. Nội dung nghiên cứu
Ờ Nghiên cứu ựa dạng di truyền các mẫu giống sử dụng các chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR.
Ờ đánh giá ựặc ựiểm nông sinh học một số tổ hợp lai F1, so sánh với bố mẹ và ựối chứng ựể chọn ra tổ hợp lai có ựặc ựiểm tốt nhất.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. đánh giá các ựặc ựiểm hình thái, nông sinh học, năng suất, chất lượng quả
3.3.1.1 Trồng thắ nghiệm
- Thắ nghiệm ựược bố trắ theo kiểu khảo sát tập ựoàn tuần tự không nhắc lại, mỗi giống trồng 25 câỵ Khoảng cách, mật ựộ: hàng x hàng = 70 x 70 cm, cây x cây = 50 x 50 cm, mật ựộ khoảng 2,67 vạn cây/hạ Trồng vụ xuân hè, gieo ngày 15/2 - trồng 15/3/2013.
- Kỹ thuật trồng, chăm sóc:
Giai ựoạn vườn ươm: hạt giống ựược gieo trên giá thể gồm trấu hun và ựất bột theo tỷ lệ 1:1. Hạt ựược gieo trong khay bầu, tưới phun mù ựủ ẩm, ựặt trong
nhà có mái chẹ Hàng ngày chăm sóc, tưới nước và giữ ẩm cho câỵ Khi cây con ựược 30 ngày tuổi (5-6 lá) thì trồng.
Giai ựoạn trồng ở ruộng sản xuất: Lượng phân bón cho 1 ha: 100kg N, 80kg P2O5, 120kg K2Ọ Bón lót toàn bộ phân lân, 1/3 phân ựạm và 1/3 kalị Lượng ựạm và kali còn lại chia ựều bón thúc vào 3 lần xới vun. Sau khi trồng cần tưới nước giữ ẩm cho ựất khoảng 75%. Vun xới lần 1 sau trồng 30 ngày, lần 2 sau trồng 60 ngày, lần 3 sau trồng 80 ngàỵ Thường xuyên nhổ bỏ cỏ dại, khi cây cao 30 - 40 cm thì làm giàn theo hình chữ Ạ Tiến hành tỉa bỏ cành phụ, chỉ ựể lại 2 thân chắnh/câỵ Theo dõi và phòng trừ bệnh xoăn vàng lá, mốc sương, héo xanh vi khuẩn bằng thuốc Daconil, Zinep; phòng trừ sâu cắn lá, sâu xám, sâu vẽ bùa, sâu xanh, sâu ựục quả bằng thuốc Sherpạ Thu hoạch khi quả bắt ựầu chuyển màu, số lần thu căn cứ vào ựặc ựiểm chắn của giống.
3.3.1.2. đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học và năng suất, chất lượng quả. Theo tiêu chuẩn ngành TCN 219-2006 và 10 TCN 557-2002 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Các chỉ tiêu theo dõi gồm:
- Dạng hình sinh trưởng: gồm dạng hữu hạn, bán hữu hạn và vô hạn.
- Thời gian từ trồng ựến ra hoa: ựược tắnh khi có 50% số cây trên ô ra hoa ựầu
- Thời gian từ trồng ựến thu quả ựợt 1: khi khoảng 50% số cây có quả chắn.
- Thời gian từ trồng ựến kết thúc thu hoạch: tắnh ựến ngày thu hết quả thương phẩm (ựối với giống hữu hạn).
- Số ựốt từ gốc ựến chùm hoa thứ nhất.
- Chiều cao từ gốc ựến chùm hoa thứ nhất.
- Chiều cao cây (giống hữu hạn): ựược tắnh từ gốc tới ựỉnh ngọn thân chắnh
- Dạng bụi cây gồm 4 dạng: 1 - cao, tán hẹp; 2 - cao tán rộng; 3 - thấp, tán hẹp và 4 - thấp, tán rộng.
- Màu sắc lá: xanh nhạt, xanh và xanh ựậm, quan sát mặt trên của phiến lá vào giai ựoạn thu chùm quả thứ 2 - 3.
- Hình dạng lá: quan sát vào thời kì thu hoạch lứa quả thứ 2 - 3, gồm dạng lá kép lông chim và dạng lá khoai tâỵ
- Kiểu chùm hoa: kiểu ựơn giản (chỉ có 1 trục chắnh, hoa mọc so le trên trục chắnh), kiểu phức tạp (chùm hoa chia thành nhiều nhánh) và kiểu trung gian (chùm hoa thường phân ra 2 nhánh chắnh).
- Số chùm quả/cây: theo dõi 5 cây, tắnh trung bình.
- Số quả/chùm: theo dõi ở chùm thứ 2, 3 của 5 cây, tắnh trung bình.
- Tổng số quả/cây: theo dõi 5 cây, tắnh trung bình.
- Tỷ lệ ựậu quả: theo dõi ngẫu nhiên 3 cây/giống, mỗi cây 5 chùm hoa từ dưới lên, tắnh trung bình. Gồm các mức: rất thấp (dưới 10%) ; thấp (10 - 20%) ; trung bình (21-40%); cao (41 - 60%) và rất cao (trên 60%).
- Khối lượng trung bình quả: cân 10 quả có kắch thước ựồng ựều ựặc trưng của giống, tắnh trung bình.
- Năng suất cá thể: cân năng suất cá thể của 5 cây/giống ở các lần thu quả. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Màu sắc vai quả khi xanh: Trắng ngà, xanh nhạt, xanh và xanh ựậm.
- Màu sắc quả chắn, có 3 mức ựánh giá: đỏ: chắn ựỏ ựều khắp quả, có trường hợp có vùng màu vàng cơ bản bao quanh vùng cuống quả; đỏ vàng: chắn có ựốm vàng nhiều hơn ở vùng cuống và rải rác ở thân quả và màu khác (mô tả và ghi rõ).
- Khắa quả: quả có khắa nông, khắa sâu hay không có khắa quả.
- đo chiều cao (H) và ựường kắnh (D) quả ựể xác ựịnh chỉ số hình dạng quả I=H/D.
- Số ngăn hạt/quả: bổ ựôi theo chiều ngang của quả, quan sát số ngăn hạt của 5 quả, tắnh trung bình.
- độ dày thịt quả: tiến hành cắt ựôi quả cà chua và dùng thước ựo ựộ dày phần thịt quả.
- độ cứng quả: dùng tay bóp vào quả ựang chắn, ựánh giá theo 3 mức: cứng, trung bình và mềm.
- độ Brix%: ựo khi quả chắn hoàn toàn, lấy ngẫu nhiên quả của chùm 2, 3 thuộc 5 cây mẫu, phân tắch chậm nhất sau thu hoạch 3 ngày, gồm các mức thấp (dưới 3,5%), trung bình (3,6 - 4,4%), cao (4,5 - 6,0%) và rất cao (trên 6%).
- Hương vị: cắt ựôi quả và ựánh giá cảm quan theo 3 mức: có hương, không rõ và hăng ngáị
- Khẩu vị: đánh giá bằng cách ăn thử cảm quan: chua, chua dịu, ngọt dịu, ngọt và ngọt ựậm.
- độ ướt thịt quả (*): cắt ựôi quả chắn và quan sát bề mặt lát cắt, ựánh giá theo 3 mức: Ướt: mặt thịt quả ướt, khi nghiêng có dịch trào ra; Khô: mặt thịt quả ráo nước; Khô nhẹ: mặt thịt quả có lấm tấm dịch quả.
- độ chắc thịt quả (*): dùng que ựường kắnh 0,5 cm xiên qua quả, cắt thịt quả thành miếng 1 cm2 rồi dùng tay bóp thịt quả, phân biệt các mức:
+ Mềm mịn: que xiên qua dễ dàng, thịt quả bóp dễ vỡ
+ Chắc mịn: que xiên qua khó hơn, thịt quả chặt bóp khó vỡ
+ Chắc bở: que xiên qua khó hơn, thịt quả chặt bóp dễ vỡ
+ Thô sượng: que xiên qua khó, thịt quả chặt bóp khó vỡ
(*) đánh giá theo hướng dẫn của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển giống rau chất lượng cao, đại học Nông nghiệp Hà Nộị
3.3.2. đánh giá ựa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR
3.3.2.1. Chiết tách DNA
− DNA ựược phân lập từ lá non của cây con 30 ngày tuổi bằng phương pháp CTAB ựược mô tả bởi (Doyle và Doyle, 1990) với một số cải tiến nhỏ.
− Quy trình chiết xuất DNA: cắt khoảng 100 mg mô lá non vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 350 ộl ựệm chiết (2% CTAB (w/v), 1,5M NaCl, 100mM Tris-HCl, 20mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β - Mercaptoethanol), tiếp tục thêm 350 ộl ựệm chiết và trộn ựều trước khi chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm 1,5ml. Ủ mẫu ở 65ỨC trong 1 giờ sau ựó bổ sung 700ộl hỗn hợp 25:24:1 (25 Phenol : 24 Chloroform : 1 isoamyl alcohol) và trộn nhẹ nhàng bằng cách ựảo ngược các ống trong 5 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng với tốc ựộ 12000 rpm ựể phân tách các pha, hút dịch lỏng phắa trên sang một ống ly tâm 1,5ml mớị Tiếp tục thêm cùng thể tắch hỗn hợp 24:1 (24 Chloroform : 1 isoamyl alcohol), ựảo trộn nhẹ nhàng trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng (12000 rpm), chuyển dịch lỏng phắa trên sang 1 ống ly tâm mớị Tủa DNA với 2 - 2,5 lần thể tắch ethanol lạnh 100%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì ựặt mẫu ở - 20oC trong khoảng 20 phút ựến 2 tiếng hoặc qua ựêm. Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt ựộ phòng trong 5 phút, tốc ựộ 12000 rpm. đổ bỏ cồn, rửa tủa hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB. Làm khô tủa trong không khắ khoảng 1 tiếng và hòa tan trong 50ộl ựệm TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0). Kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA bằng ựiện di trên gel agarose 1% ở hiệu ựiện thế
100V trong khoảng 15 phút. độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức ựộ ựứt gãy và nồng ựộ DNA tổng số.
3.3.2.2. Chạy PCR ựánh giá ựa dạng di truyền bằng chỉ thị SSR
− Mồi SSR: sử dụng 10 cặp mồi SSR. Tên, trình tự và nhiệt ựộ gắn mồi ựược trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Trình tự và nhiệt ựộ gắn mồi các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ựa dạng di truyền các mẫu giống cà chua nghiên cứu
STT Tên mồi Trình tự mồi Ta (oC) Tham khảo
F: 5'-tcc tcc ggt tgt tac tcc ac 1 SSR-304
R: 5'-tta gca ctt cca ccg att cc 49 F: 5'-tgt gtt gga tgt ttg gca ct
2 SSR-108
R: 5'-gcc att gaa act tgc aga ga 48.5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Parmar và cộng sự (2010)
F: 5'-aag aaa ctt ttt gaa tgt tgc 3 Tom 49-50
R: 5'-att aca att tag aga gtc aag g 43 F: 5'-gca ttg att gaa ctt cat tct cgt cc 4 Tom 8-9 A
R: 5'-att ttt gtc cac caa cta acc g 49 F: 5'-ggt gaa aag agc aaa ata gt
5 Tom 322-323
R: 5'-ttt gta atc cat gtc tat aa 38 F: 5'-gaaatctgttgaagccctctc 6 Tom 41-42 R: 5'-gactgtgatagtaagaatgag 48 F: 5'-ggcaaagaaggacccagagc 7 Tom 61-62 R: 5'-ggtgcct aaaaaagttaaat 48 F: 5'-cggactcccagaccctcat 8 Tom 69-70 R: 5'-accaatgatactactaccacaac 48 F: 5'-tggtcaccttcaacttttatac 9 Tom 202-203 R: 5'-aaatgataatgaaat ggagtga 45 F: 5'-ttctttattttggaggta 10 Tom 300-301 R: 5'-atcacaaattcaaatcac 45 Meng và cộng sự (2010) Chú thắch: Ta - nhiệt ựộ gắn mồi − Thành phần phản ứng PCR: thể tắch mỗi phản ứng là 25ộl, gồm: 0,2ộl (25mM) hỗn hợp 4 loại dNTP, 5ộl 5x buffer, 3ộl MgCl2 nồng ựộ 25mM, 0,1ộl
Taq DNA polymerase, 1,25ộl mỗi mồi SSR (nồng ựộ mồi 10ộM), 1-2ộl DNA khuôn, thêm nước cất ựến 25ộl.
− Chu kỳ nhiệt: 95oC/3 phút, 35 chu kỳ (95oC/30s, TaoC/100s, và 72oC/2 phút), kết thúc phản ứng bằng bước kéo dài ở 72oC/10 phút (với Ta là nhiệt ựộ gắn mồi, xem bảng 3.3). Sản phẩm PCR ựược ựiện di trên gel agarose 2% (w/v) trong ựệm TAE 1X, hiệu ựiện thế 5V/cm, sau ựó nhuộm ethidium bromide và chụp hình trong buồng UV.
− Phân tắch dữ liệu: sự vắng mặt hay có mặt của các vạch băng trên các mẫu giống ựược ghi lại trong một ma trận nhị phân tương ứng là 0 hoặc 1. Sự tương ựồng về di truyền giữa các mẫu giống ựược tắnh toán bằng cách sử dụng hệ số tương ựồng (Sij) ựược mô tả bởi (Nei và Li (1979)):
Trong ựó: Nij là số vạch băng chung của giống thứ i và j; Nivà Nj là số vạch băng tương ứng ở mẫu giống thứ i và j.
Dữ liệu ựược sử dụng ựể xây dựng cây phả hệ bằng phương pháp ghép cặp chuỗi dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng UPGMA (Unwaited Pair Group Method using Arithmetic Averages) trên phần mềm NTSYSpc Version 2.1 (Rohlf, 2000).
3.3.3. đánh giá khả năng kết hợp của các tổ hợp lai
Ờ Khả năng kết hợp của các dòng bố mẹ ựược xác ựịnh qua mức biểu hiện ưu thế lai của con lai F1. Mức biểu hiện ưu thế lai của con lai càng cao thì các dòng bố mẹ càng có khả năng phối hợp caọ Có 3 loại ưu thế lai:
+ Ưu thế lai giả ựịnh:
+ Ưu thế lai thực:
+ Ưu thế lai tiêu chuẩn:
Trong ựó: F1 là giá trị của con lai; P1 là giá trị của dòng bố mẹ 1; P2 là giá trị của dòng bố mẹ 2; Pb là giá trị của dòng bố mẹ cao nhất; S là giá trị của giống tiêu chuẩn
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
để chọn tạo ựược giống cà chua mới cho năng suất cao, chất lượng tốt thì việc thu thập và ựánh giá nguồn gen là việc làm vô cùng cần thiết. Sở hữu nguồn gen càng ựa dạng thì cơ hội chọn tạo giống thành công càng caọ Vì vậy, việc ựánh giá sự ựa dạng nguồn gen là việc làm rất cần thiết trong các chương trình chọn giống. Nhận thức ựược ựiều này, Trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng Ờ đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã tiến hành thu thập ựược một tập ựoàn nguồn gen cà chua phong phú về hình tháị Qua kết quả khảo sát ban ựầu ựã rút ra ựược một số mẫu giống có các ựặc ựiểm tốt. Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm ựánh giá ựa dạng di truyền của các mẫu giống kể trên từ ựó phân nhóm các mẫu giống phục vụ cho công tác lai tạo giống cà chua mớị
4.1. đánh giá ựa dạng di truyền các mẫu giống bằng chỉ thị hình thái
4.1.1. đa dạng về một số ựặc ựiểm sinh trưởng, ựặc ựiểm hình thái và cấu trúc cây
Dựa vào kết quả ựánh giá kiểu hình sinh trưởng có thể phân chia các mẫu giống nghiên cứu thành 2 nhóm chắnh: nhóm I sinh trưởng vô hạn và nhóm II sinh trưởng hữu hạn. đối với nhóm sinh trưởng hữu hạn, khi cây phát triển ựến một ựộ cao nhất ựịnh thì ở phần ngọn sẽ ra một chùm hoa cuối cùng, sau ựó thân chắnh ngừng sinh trưởng. đặc ựiểm này ựược kiểm soát bởi alen lặn sp (self- pruning) nằm trên nhiễm sắc thể số 6 (Morrison, 1998). Thuộc nhóm I có 11 mẫu giống gồm: 269, 183, 186, 252, 241, 257, 261, 282, 274, 293 và 299; nhóm II gồm 15 mẫu giống còn lạị Riêng giống ựối chứng Savior có dạng hình sinh trưởng bán hữu hạn.
Tắnh chắn sớm là yêu cầu rất quan trọng và là mục tiêu chọn giống của nhiều loại cây trồng trong ựó có cây cà chuạ Có 2 dạng chắn sớm là chắn sớm sinh học (thời gian từ trồng ựến ra quả ựầu) và chắn sớm kinh tế (thời gian từ trồng ựến thu quả lần ựầu). đối với cây cà chua, tắnh chắn sớm kinh tế có giá trị và ựược quan tâm hơn. Dựa vào thời gian sinh trưởng của các mẫu giống chúng tôi phân chia các mẫu giống nghiên cứu thành 3 nhóm: nhóm chắn sớm có thời gian từ trồng ựến thu quả lần ựầu từ 55 - 60 ngày gồm 3 mẫu giống là 194, 196
và 293; nhóm trung bình (61-70 ngày) gồm ựối chứng Savior và 7 mẫu giống là 241, 264, 27, 190, 252, 300 và 254; nhóm chắn muộn (>70 ngày) gồm các mẫu giống còn lạị
đặc ựiểm hình thái lá phụ thuộc chủ yếu vào ựặc ựiểm của giống, ựánh giá các ựặc ựiểm hình thái lá có thể giúp xác ựịnh sự sai khác hay tương ựồng giữa các mẫu giống. Chúng tôi sử dụng 2 chỉ tiêu về hình thái lá ựể phân biệt các mẫu giống nghiên cứu gồm ựộ xanh lá và dạng lá. Trong số 26 mẫu giống nghiên cứu, ựộ xanh lá gồm 2 dạng là xanh và xanh ựậm, trong ựó chỉ có 4 mẫu giống có lá xanh ựậm là 269, 295, 183 và 241. Về dạng lá, tất cả các mẫu giống ựều có dạng lá kép lông chim. Như vậy, không có sự sai khác về dạng lá ở các mẫu giống nghiên cứụ
Dạng bụi cây cũng là một ựặc ựiểm quan trọng có thể sử dụng ựể phân nhóm các giống nghiên cứu, gồm 4 dạng: 1 Ờ cao, tán hẹp; 2 Ờ cao tán rộng; 3 Ờ thấp, tán hẹp và 4 Ờ thấp, tán rộng. Dạng 1 và 2 là các mẫu giống cao cây tương ứng với kiểu hình sinh trưởng vô hạn, dạng 3 và 4 tương ứng với kiểu sinh trưởng hữu hạn thấp câỵ Thuộc dạng 1 có 8 mẫu giống gồm: 269, 183, 252, 241, 261, 282, 293 và 299. Dạng 2 chỉ gồm 2 mẫu giống là 186 và 257. Dạng 3 gồm 15 mẫu giống: 234, 190, 192, 194, 201, 295, 27, 254, 196, 264, 277, 297, 26, 274 và 275. Dạng 4 gồm duy nhất mẫu giống 300.
Chiều cao chùm hoa thứ nhất là một ựặc ựiểm quan trọng ựược quan tâm trong chọn giống. Vị trắ chùm hoa thứ nhất có ảnh hưởng trực tiếp ựến vị trắ, số lượng và sự phát triển các chùm hoa tiếp theo do ựó ảnh hưởng ựến số quả/cây,