* Xét nghiệm không đặc hiệu
- Xét nghiệm máu: các kết quả xét nghiệm máu cũng có thể chỉ ra thoái hóa dạng tinh bột:
+ Số lượng tiểu cầu cao 5-10% trong số những bệnh nhân thoái hóa dạng tinh bột
+ Mức độ Alkaline phosphatase huyết thanh (một loại enzym có trong xương và gan) có thể tăng, gặp ở khoảng 25% bệnh nhân u dạng tinh bột.
+ Hemoglobin thấp không phải là đặc điểm nổi bật trong thoái hóa dạng tinh bột nhưng có thể xảy ra do rối loạn chức năng thận, đa u tủy hoặc chảy máu dạ dày.
- Điện tâm đồ (EKG) là một thử nghiệm phát hiện và ghi lại dòng chảy của xung điện trong tim. Điện tâm đồ được thực hiện trên bệnh nhân thoái hóa dạng tinh bột sẽ xuất hiện điện thế thấp và dấu hiện của cơn đau tim có thể xuất hiện
- Siêu âm tim
* Xét nghiệm đặc hiệu - Nhuộm đỏ Congo
+ Nguyên tắc: cố định của chất đỏ Congo trên chất dạng bột, có lẽ do cấu trúc có hướng theo dãy thẳng (loại Celluloza) của chất này.
+ Các loại dung dịch sử dụng: - Dung dịch Ethanol kiềm:
Ethanol 80 độ bão hoà Chloruasodium 50ml Dung dịch nước 1% sút 0,5 ml
Lọc sau đó dùng ngay trong vòng 15p sau khi điều chế. - Dung dịch mẹ:
Ethanol 80 độ bão hoà đỏ Congo và Chloruasodium - Dung dịch nhuộm:
Lấy 50ml dung dịch mẹ rồi cho vào 0,5ml dung dịch nước 1% sút, lọc đi sử dụng trong vòng 15 phút sau điều chế.
+ Cách tiến hành: tốt nhất là bệnh phẩm được cố định trong formol trung tính, cồn tuyệt đối hoặc Carnoy, cắt đóng băng hoặc chuyển đúc parafin. Mảnh cắt parafin sau khi loại parafin được đưa vào nước.
Có 3 phương pháp nhuộm, nhưng phương pháp cho kết quả tốt nhất là Phương pháp đỏ Congo kiềm theo Puchtler, Sweal và Levine 1962, được tiến hành tho các bước sau:
- Tẩy Parafin - Chảy nước
- Nhuộm trong Hemalun 10p - Rửa qua 3 lần ngâm nước cất
- Chuyển vào một dung dịch ethanol bão hoà Chlorua sodium trong 20’ - Nhuộm trong dung dịch cồn kiềm đỏ Congo trong 20’
- Loại nước nhanh trong 3 lần ngâm cồn tuyệt đối. Làm qua 2 lần ngâm xylen, gắn Bomcanada.
- Chất dạng bột: bắt màu từ hồng tươi đến đỏ
- Soi kính hiển vi phân cực: tính lưỡng chiết mạnh và tính đổi sắc - Soi kính hiển vi huỳnh quang: huỳnh quang đỏ
Hình 6: Hình ảnh mô bệnh học u dạng tinh bột
- Sử dụng phương pháp hoá mô miễn dịch để xác định amyloid AA, amyloid AL và amyloid ATTR. Từ đó xác định được thể bệnh và xác định được tính chất gia đình của bệnh.
Hoá mô miễn dịch là sự kết hợp giữa giữa phản ứng miễn dịch và hoá chất để làm hiện rõ các kháng nguyên hiện diện trong mô bào (bào tương, màng tế bào, nhân).
Kỹ thuật hoá mô miễn dịch được dùng không những chỉ để xác định một mô có hoặc không có kháng nguyên đặc hiệu, mà còn để xác định tình trạng kháng nguyên của những tế bào đặc hiệu trong mô và vị trí của kháng nguyên trong tế bào. Nhờ đó có thể xác định được dòng tế bào, xác định rõ tính chất sinh học của quần thể tế bào trong cùng một dòng, và chức năng khác nhau của các loại tế bào, thậm chí còn xác định được tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus.
Hoá mô miễn dịch là một kỹ thuật thuộc mô bệnh học, cho phép chứng minh tính đặc hiệu của các cấu trúc mô và tế bào trên tiêu bản mô học bằng
cách dùng các kháng thể đánh dấu đặc hiệu để phát hiện những đặc tính kháng nguyên trên bề mặt tế bào. Tất cả các kỹ thuật đánh dấu miễn dịch đều dựa trên cơ sở tác động qua lại đặc hiệu của kháng nguyên – kháng thể. Các kháng thể là các sản phẩm của động vật được miễn dịch hoá với một chất ngoại lai là kháng nguyên. Có 2 loại kháng thể: đơn dòng và đa dòng. Các kháng thể dù là đơn dòng hay đa dòng đều biểu hiện tính đặc hiệu cao đối với mối liên kết kháng nguyên, người ta lợi dụng đặc điểm này để áp dụng vào phản ứng hoá mô miễn dịch.
Có 2 kỹ thuật đánh dấu miễn dịch làm khuyếch đại mối liên kết kháng nguyên - kháng thể là Peroxydase - Anti - Peroxydase (PAP) và kỹ thuật Biotin - Strept - Avidine (BSA). Cả hai hệ thống này hoạt động bằng cách gắn một liên hợp enzym có khả năng sinh ra một kết tủa bắt màu với sự có mặt của cơ chất và một chất sinh màu vào phức hợp kháng thể tiên phát và kháng nguyên. Các tiêu bản được khử nến rồi được xử lý bằng một dung dịch oxy già để phá huỷ tất cả các hoạt tính peroxydase nội sinh đối với trường hợp dung peroxydase để đánh dấu. Sau đó, dùng huyết thanh bình thường hoặc phong toả các vị trí gắn kết không đặc hiệu. Sơ đồ phản ứng gồm 4 giai đoạn, sau mỗi giai đoạn được rửa trong dung dịch đệm:
+ Giai đoạn 1: vùi tiêu bản với kháng thể tiên phát đặc hiệu, là kháng thể đơn dòng được pha chế từ huyết thanh chuột hoặc đa dòng từ thỏ hay dê.
+ Giai đoạn 2: vùi tiêu bản với kháng thể liên kết kháng immunoglobulin.
+ Giai đoạn 3: dùng phức hợp hoà tan của PAP để gắn vào các vị trí tự do của kháng thể liên hợp.
+ Giai đoạn 4: làm hiện rõ phức hợp kháng nguyên - kháng thể - enzym bởi một chất màu nâu đỏ trên các vị trí kháng nguyên với sự có mặt của peroxydase hoặc diaminobenzidin (DAB) + H2O2
Trong nghiên cứu của chúng tôi,các bệnh phẩm nghiên cứu được nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể đơn dòng CK7, CK19, CK20, Ki-67, p53 và Her-2/neu, sử dụng kỹ thuật Biotin- Avidin Complex (ABC), đánh giá sự bộc lộ p53, Ki-67:
1. Bệnh phẩm được cắt dày 3µm, dàn trên các lam kính phủ Silane 2. Ủ qua đêm ở nhiệt độ 56oC
3. Tẩy nến bằng Toluen và cồn như nhuộm thông thường 4. Rửa nước trong 5 phút
5. Bộc lộ kháng nguyên bằng nhiệt: đặt tiêu bản trong dung dịch citrate nồng độ 0,01 mol/l, pH = 6,0, đun sôi trong nồi áp suất trong 5 phút 6. Rửa nước cất trong 5 phút
7. Khử peroxidase nội sinh bằng H2O2 trong 10 phút 8. Rửa nước cất trong 5 phút
9. Ủ kháng thể thứ nhất 1 giờ
10. Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút 11. Ủ kháng thể thứ hai 30 phút
12. Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút 13. Phủ ABC trong 30 phút
14. Rửa tiêu bản bằng dung dịch TBS 3 lần, mỗi lần 5 phút 15. Ủ với dung dịch màu DAB trong 10 phút
16. Rửa nước chảy trong 5 phút
17. Nhuộm nhân với Hematoxylin trong 30 giây 18. Tẩy nước, phủ lamen.
Đọc tiêu bản: Hình ảnh trên tiêu bản của xét nghiệm hoá mô miễn dịch ghi nhận việc có hay không phản ứng miễn dịch kháng nguyên - kháng thể. Nếu có phản ứng miễn dịch xảy ra trên tiêu bản sẽ xuất hiện màu nâu (DAB)
tại vị trí cần đánh giá và bác sỹ giải phẫu bệnh sẽ đưa ra kết luận dương tính (+), ngược lại là âm tính (-).
Kiểm soát chất lượng:
- Kiểm tra chất lượng hoá chất, thuốc nhuộm thường xuyên, đảm bảo đậm độ hợp lý với thời gian nhuộm.
- Sử dụng chứng âm, chứng dương để đối chiếu. - Hạn chế âm tính giả, dương tính giả:
+ Sử dụng lam kính mới, không bị ẩm mốc, có đánh số rõ ràng cho từng bệnh phẩm.
+ Sử dụng lưỡi dao cắt tiêu bản không quá nhiều lần (trung bình 1 lưỡi dao cho 5 bệnh phẩm).
+ Cắt lát bệnh phẩm mỏng khoảng 3µm.
+ Dàn đều bệnh phẩm lên lam kính, không bị nhăn, không bị rách. + Tẩy sạch parafin bám trên lam kính.
+ Trong quá trình ủ kháng thể không được để khô tiêu bản.
+ Đảm bảo đúng và đủ khi thao tác theo khuyến cáo của nhà cung cấp kháng thể.
+ Dán lamen lên lam kính thật kín, không để không khí ám vào. Tất cả các tiêu bản được tiến hành nghiên cứu trên kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại khác nhau do hai chuyên gia giải phẫu bệnh có kinh nghiệm kiểm định.