CH NG 3 VT L IU VẨ PH NG PHÁP NGHIểN CU
3.2. Vt l iu nghiên cu
3.2.1. Ch ng vi sinh v t, plasmid
- Ch ng vi khu n Aeromonas hydrophila 4.4Tăđ c phân l p t m t m u cá tra
b b nhăvàoăthángă9ăn mă2019ăt i Thành ph C năTh và ch ng th c khu n
th PVN02ăđ c phân l p t m uăn c ao nuôi cá tra Thành ph C năTh
b i nghiên c u c a T Quang Vinh và c ng s tr căđóă[11].
- Ch ng E. coli BL21ă(DE3)ăđ c s d ng cho vi c bi u hi n endolysin tái t h p.
- PlasmidăpET28a(+)ăđ c s d ng làm vector bi u hi n endolysin tái t h p.
T t c các ch ng vi sinh v t và plasmid pET28a(+) nêu trên đ căl uătr và cung c p b i nhóm nghiên c u th c khu n th c a PGS.TS. Hồng Anh Hồng t i B mơn Công ngh Sinh h c, Khoa K thu t Hóa h c,ăTr ngă i h c Bách Khoa ậ i h c Qu c gia TP. HCM.
3.2.2. Mơi tr ng, hóa ch t, v t li u
- Môiătr ng: Luria-Bertani Broth (LB) (hãng Himedia, nă ), Tryptone Soya
Broth (TSB) ((hãng Himedia, nă ).
- Hóa ch t: Q5® High-Fidelity Master Mix (2X) (New England Biolabs, M ); T4 DNA ligase, enzymeăc tăgi iăh nă(BamHI, HindIII) (New England Biolabs, M ); imidazole (Biobasic, Canada); IPTG (Bioline, M ); GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific, M ); PureLink™ă Quickă Plasmidă
Miniprep Kit (Invitrogen,ăM );ăhóaăch tăđi nădiăgelăagarose:ăagarose,ăGelRedă
3.2.3. Thi t b , d ng c
Máy luân nhi t PCR, máy ly tâm, máy vortex, b n nhi t,ămáyăđoăpH,máyăđoă
m tăđ quang, h th ng ch p nh gel UV, t nuôi c y l c,ăcânăđi n t , t đông
l nh, t l nh, t c y vi sinh, t m, t s y, n i h p vô trùng, h th ngăđi n di gel agarose, h th ng đi n di SDS-PAGE và các thi t b , d ng c khác.
3.3. Ph ng pháp nghiên c u
S ăđ 3.1.ăS ăđ quy trình nghiên c u. C t b ng RE Tinh s ch
Plasmid pET-28a(+)
N i b ng ligase
Phân tích trình t endolysin phage PVN02 Genome phage PVN02
S n ph m gene endolysin endolysin
PCR
T i u hóa codon vƠ t ng h p gene endolysin
C t b ng RE Tinh s ch
Các dòng khu n l c E. coli BL21 (DE3) đư bi n n p Plasmid pET-28a(+) mang gene endolysin
Gene endolysin đư c t RE Plasmid pET-28a(+) đư c t RE
Bi n n p vào E. coli BL21 (DE3)
Kh o sát ho t tính kháng Aeromonas hydrophila c a d ch endolysin tái t h p thô Ki m tra endolysin
tái t h p thô b ng SDS-PAGE
D ch endolysin tái t h p thô
Thu nh n và phá t bào
D ch t bào bi u hi n
Bi u hi n endolysin
Các khu n l c E. coli BL21 (DE3) mang pET-28a(+)-gene endolysin
Gi i trình t plasmid Ki m tra trình t gene endolysin
3.3.2. Phân tích trình t endolysin cell wall hydrolase
Vi c phân tích trình t geneăendolysinăđ : (1) t iă uăhóaăcodonăkhiăbi u hi n t bào E. coli; (2)ăđánhăgiáătínhăk n c c aăproteinăđ đ nhăh ng cho quá trình tinh s ch; (3)ăxácăđ nh vùng g nămàngăđ d đốnăho t tính c a enzyme endolysin thơ. Trình t amino acid c a endolysinăđ căxácăđnh d a vào nghiên c uătr căđóăv i mã s truy c p QLI47613.1 trên Genbank, NCBI [11]. Domain ch că n ngă c a
endolysinăđ c phân tích s d ngăc ăs d li u Conserved Domain Database (CDD)
trên NCBI. Vi c d đoán c u trúc c aăendolysinăđ c th c hi n d a trên Phyre2 server [82].ă k n c c aăproteinăvàăxácăđ nh các xo n xuyên màng đã đ c d
đoánă b ng cách s d ngă cácă ch ngă trìnhă sau:ă TMpred (https://embnet.vital-
it.ch/software/TMPRED_form.html), transmembrane topology prediction server ậ
HMMTOP (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html) và TCDB (http://www.tcdb.org/progs/?tool=hydro) [78].