CH NG 3 VT L IU VẨ PH NG PHÁP NGHIểN CU
3.3.8. Kho sát h ot tính kháng vi khun Aeromonas hydrophila cad ch
Ho t tính kháng vi khu n A. hydrophila c a d ch endolysin tái t h p thô đ c kh o sát b ngăph ngăphápăspot test đ đánhăgiáăkh n ngălyăgi i ngoài vàăph ngă
pháp tr iăđ a,ăđ m khu n l c đ đánhăgiáăkh n ngă c ch sinhătr ng t bào vi khu n.
Ph ngăphápăspotătest [87]
Vi khu n A. hydrophila đ c nuôi c y trong 10mlămôiătr ng TSB 370C, l c
quaăđêm.ăSauăđóăc y chuy n 100µl d ch nuôi c y vào 10mlămôiătr ng TSB, nuôi
c y l c choăđ năkhiăOD600nmăđ t 0.6-0.8. Sauăđóăd̀ngăqueăt măbơngăvơătr̀ngănhúngă
vào d ch vi khu năđãăchu n b sauăđóătr iăđ u trên m t th chămôiătr ng TSA. Ti n hành tr i d ch khu n cho t i khi th y m t th ch khơ. Sauăđóăđ tăcácăđ aăgi y tr ng vô trùng trên b m t th chămôiătr ng TSAăđãătr i d ch vi khu n th nghi m.
Chu n b dchăendolysinăthơăcóăđ pha lỗng theo c p s 2 v iăđ m ly gi i t bào: khơng pha lỗng, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Dùng micropipet hút 15 l d ch endolysin
thô đãăchu n b trên vàăđ i ch ng là 15 l dung dchăđ m ly gi i cho vào các đ aă
gi y tr ng trên b m t th chăTSAăđãătr i d ch khu n.ăSauăđóă cácăđ aă 370C ni
quaăđêmăvàăquanăsátăvịngăly gi i.
Ph ngăphápătr iăvàăđ m khu n l cătrênăđ aăth ch [88]
Ho t tính kháng vi khu n A. hydrophila c a endolysin tái t h p c ngđ c xác
đnh b ngăph ngăphápătr i đ a,ăđ m khu n l c.
Chu n b d ch vi khu n th nghi m: Vi khu n A. hydrophila đ c nuôi c y trong
10mlămôiătr ng TSB 370C, l c quaăđêm.ăSauăđóăc y chuy n 100µl d ch ni c y
vào 10mlămơiătr ng TSB, nuôi c y l c choăđ năkhiăOD600nmăđ t 0.6-0.8. Sauăđóă
ti n hành pha lỗng d ch t bàoănh ăsau: L y 1ml d ch t bào cho vào 9mlăđ m Tris-
HClăđ c n ngăđ pha loãng 10-1, và ti p t căphaăloãngăđ n n ngăđ là 10-4. Sauăđóă
hút 1ml d ch vi khu n A. hydrophila ly tâm 12000rpm, 10 phút, b d ch và thu nh n
t bào.ăSauăđóăti n hành tr n t bào vi khu n v i các nghi m th c sau: nghi m th c
500µL d ch endolysin tái t h p thơ tr n v i 500µLăđ m Tris-HCl, nghi m th căđ i ch ng 1000µLăđ m Tris-HCl. H n h păsauăđóăđ c nhi tăđ phòng và l y m u theo các kho ng th i gian khác nhau trong 60 phút và tr i 100µL m u trênăđ aăth ch
mơi tr ng TSA (đ i v i nghi m th căđ i ch ngăđ m Tris-HCl thì pha lỗng thêm 10 l n b ngăđ m Tris-HClătr c khi tr iăđ a) và quaăđêmă 370C.
c k t qu : Sau khi quaăđêm, đ m các khu n l c vi khu n A. hydrophila m c
trênăcácăđ aămôiătr ng và ghi nh n k t qu .
3.3.9. l p l i và ph ng pháp x lý s li u
Các thí nghi m trong nghiên c uăđ c th c hi n 3 l n l p l i và các s li uăđ c x lý b ng ph n m m IBM SPSS Statistic 20.
CH NG 4. K T QU VÀ TH O LU N
4.1. K t qu phân tích trình t endolysin và t i u hóa gene endolysin
Endolysin cell wall hydrolase c a phage PVN02 có trình t nucleotide dài 540bp, có chi u dài 179 amino acid (kho ng 19,6 kDa) thu căkhungăđ c m (ORF) s 52 trong trình t b gene c a phage PVN02. K t qu phân tích domain protein trên Conserved Domain Database cho th y endolysin này ch a domain hydrolase_2 thu c hydrolase_2 superfamily (accession: pfam07486). K t qu t ch ngătrình TMpred và TCDB cho th y r ng endolysin có xo n xun màng v trí t amino acid 7ăđ n 26 (hình 4.1). Ngồi ra, k t qu phân tích d đốnăc u trúc d a vào Phyre2 cho th y
endolysinăđ c d đốnăcóăcácăc u trúc d ng xo n -helix và có c các phi n (hình
4.2).
Hình 4.1. K t qu phânătíchăđ k n c c a endolysin cell wall hydrolase.
(đ ng màu xanh d ng: hydropathy-đ k n c/ a n c; đ ng màu đ : amphipathicity-l ng ph n; vùng thanh bar màu cam nh t: vùng ch a xo n xuyên màng)
Hình 4.2. Mơ hình c u trúc 3D c a endolysin cell wall hydrolase. (C u trúcăđ c d đốnăb ngăch ngătrìnhăPhyre2) (C u trúcăđ c d đốnăb ngăch ngătrìnhăPhyre2)
Geneăendolysinăcellăwallăhydrolaseăđãăđ c t iă uăhóa nh ăthayăth b ba m
đ u GTG b ng b ba ATG; thay th các b ba mã hóa cho amino acid arginine có t l th pănh ăthayăth b ba AGA, CGA b ng CGT; hay thay th b ba CCC mã hóa cho proline b ng b ba CCG. Chi ti t các codon hi m và các codon thay th đ c trình bày trong b ng 4.1. Trong quá trình t iă uăhốăgen,ăngồiăvi c t iă uăcácăcodonă
hi m, m t s codon khác có t n s xu t hi n th păc ngăđ c thay th b i các codon có t n s caoăh nă E. coli đ t iă uăchoăvi c bi u hi n endolysin.
B ng 4.1. T ng h p các codon có t n s xu t hi n th p E. coli có trên gene endolysin cell wall hydrolase. [89] endolysin cell wall hydrolase. [89]
Gene
Endolysin B ăba Amino acid
T ăl ă /Fractio n T nă s /1000ă (Frequency /Thousand) V ătríăaaă trên trình t ăc aă endolysin B ăbaă thay th Cell wall hydrolase /PVN02 AGA R (Arginine) 0.07 3.6 61 CGT CGA R (Arginine) 0.07 3.8 66; 69; 155 CGT CCC P (Proline) 0.13 5.4 100 CCG AGG R (Arginine) 0.04 2.1 103 CGC
ATA I (Isoleucine) 0.11 6.8 125 ATT
GTG Start codon ATG
Trình t gene endolysinăcellăwallăhydrolaseătr c khi t iă uăhóa:
5'- GTG CAA AAT ATC ATC AAA ATC TTA GTA ATT TTG CTG ACT TTG TCG AGT TTT TCT TGC AAA GCA TCA GCA AAT TTT GGC CCT ATT AAT GAC AAC ACC CTC GCC TAT GTG CAG GCT GGG TAC TAC GAG GCC CGC GAT GGT GGC CGC CTC GCT ATG AAG CTC GTC ATG TCT GCC ACA TAC AAC AGA GTC GTG GAT GGG CGA TGG CCT CGA TCA GCG AAA CGT GTG GTG TGG CAG AGC GGG CAA TAC GCG TGG ACT GGT GGG CAG CGG CAC CGT GCG AGT CTC TAT CCT AAG GCC ACG GCC CCC GCC GAC AGG GCG GCC CTC GCA GAG GCC GTC TCT CTG GCC CGC TCG CTG CGC GCC GGC GAC TGG GAG CCC TCT ATA AGC GCT AAC CAT TTC TTG AGC CCT GGC GCG CTC TCA GGG CCG TTC CCG CGA TGG GCG CGG TGT ACC GCT GCG CTG GCG GCT GAG GGT CGA TGC GTG TCA TAT AAA GGG CAG AAA GTC CGT AGC CCT GAC TTC ACT TAC AAC GGC ACC TGG TTC TAC ACT TTG TAG -3'
Trình t gene endolysin cell wall hydrolase sau khi t iă uăhóa (các ch thayăđ i so v i trình t ch aăt iă uăhóaăđ c inăđ m):
5'- ATG CAA AAC ATC ATC AAA ATC TTA GTA ATT TTA CTG ACT CTG AGC AGC TTT TCT TGC AAA GCA AGC GCG AAC TTT GGC CCT ATT AAT GAC AAC ACC CTG GCC TAT GTG CAG GCA GGC TAC TAC GAG GCC CGC GAT GGT GGC CGC CTG GCG ATG AAA CTG GTG ATG TCT GCC ACC TAT AAC CGT GTT GTG GAT GGT CGT TGG CCG CGT AGC GCG AAA CGT GTG GTT TGG CAG AGC GGT CAG TAT GCA TGG ACC GGT GGC CAG CGT CAT CGT GCA AGC CTG TAT CCG AAA GCA ACC GCC CCG GCA GAT CGC GCG GCG CTG GCG GAA GCC GTT TCT CTG GCG CGC TCT CTG CGT GCG GGC GAT TGG GAA CCG TCT ATT AGC GCG AAC CAT TTT CTG AGT CCG GGT GCG CTG AGT GGT CCG TTT CCG CGT TGG GCG CGT TGT ACC GCC GCG CTG GCG GCC GAA GGT CGT TGT GTG AGT TAT AAA GGT CAG AAA GTG CGT AGC CCG GAT TTT ACC TAT AAC GGC ACC TGG TTC TAT ACC CTG TAA -3'
K t qu tính tốn các thơng s sau khi t iă uăhóaăcodonăc a endolysin d a trên công c CAIcalănh ăsau:ăCAIălàă0.93ăvàăthànhăph n %GC là 56.48%. CAI là m t ch s đoăl ng gi a vi c s d ngăcodonăđ ngăngh aă(synonymousăcodonăusage)ăc a m t gene và t n s codonăđ ngăngh aăc a m t b tham chi u [84], là m t ch s quan tr ng
đ đoăl ng s bi u hi n c a protein [90]. TheoăGenscriptăthìăCAIălýăt ng cho bi u hi n protein trong t bào bi u hi n mong mu n là t 0.8-1.0 và thành ph n GC trong kho ng t 30-70% [91]. Doăđó,ăcácăthơngăs c a endolysin sau khi t i uăhóa codon
4.2. K t qu t o vector bi u hi n mang gene endolysin tái t h p
Gene endolysin cell wall hydrolase sau khi t iă uăhóaăđãăđ c t ng h p và chèn vào vector pUC19. Trình t c a gene cell wall hydrolase sau khi t ng h p c ngăđãă đ c gi i trình t b i cơng ty Sinh hóa Phù Sa (ph l c). K t qu cho th y gene cell
wallăhydrolaseăđãăđ c t ng h p, t o dịng thành cơng, trình t geneăđúngăv i trình
t đãăthi t k .
Gene endolysin đãăđ c khu chăđ i và thu nh n t ph n ng PCR v i c p m i
đ c hi u ORF52_F và ORF52_R. K t qu đi n di gi ng 2 (hình 4.3) cho th y đãă
khu chăđ i m tăđo n gene cóăkíchăth c n m gi a v ch DNA chu n 400bp và 600bp
đúngăv iăkíchăth c d đốn s n ph m gene cell wall hydrolase khi thi t k m i là
562bp. K t qu đi nădiăc ngăchoăth y ch ng âm không xu t hi n v ch DNA nào trên gel gi ng 1 (hình 4.3) cho th y ph n ng PCR thu nh n gene endolysin cell wall hydrolase đãăđ c th c hi n thành cơng.
Hình 4.3. K t qu PCR khu ch đ i gene endolysin cell wall hydrolase. (Gi ng 1: ch ng âm; Gi ng 2: gene cell wall hydrolase) (Gi ng 1: ch ng âm; Gi ng 2: gene cell wall hydrolase)
Các khu n l c E. coli BL21 (DE3) m cătrênăđ aăth ch LB sau khi bi n n p plasmid tái t h p đ c ch n ng u nhiên và PCR khu n l c v i c p m i ORF52_F
và ORF52_R đ c hi u cho gene endolysin cell wall hydrolase. K t qu đi n di s n ph m PCR cho th y 07 khu n l căđ c ch n (t gi ngă1ăđ n gi ng 7) đ u xu t hi n m t v ch DNA cóăkíchăth c n m trong kho ng 400-600bp,ăt ngă ng v iăkíchăth c 562bp c a gene endolysin cell wall hydrolase đãăthi t k (hình 4.4).
Hình 4.4. K t qu PCR khu n l c E. coli BL21 (DE3) ch a plasmid pET28a(+) mang gene cell wall hydrolase.
(Gi ng 1 đ n 7: Khu n l c E. coli BL21 (DE3) ch a plasmid pET28a(+ ) mang gene cell wall hydrolase; Gi ng (-): ch ng âm)
T k t qu PCR khu n l c, ch n m t trong s các khu n l c trên (khu n l c 3)
đ nuôi c yătrongămôiătr ng LB l ng có b sung kháng sinh kanamycin 50µg/ml,
sauăđóătáchăchi t, tinh s ch plasmid và g i m u gi i trình t v i c p m i có trên vector
pET-28a(+) là T7 promoter (F) và T7 terminator (R).
K t qu s p gióng c t (hình 4.5) sau khi gi i trình t cho th y plasmid mang gene endolysin cell wall hydrolase có trình t chính xác so v i trình t c a gene endolysin cell wall hydrolase đã thi t k .
Hình 4.5. K t qu s p gióng c t trình t sau khi gi i trình t m u plasmid tái t h p pET-28a(+)-endolysin v i trình t gene endolysin cell wall hydrolase.
T các k t qu trên đãă choă th y plasmid tái t h p pET-28a(+) mang gene endolysin cell wall hydrolase đãđ c bi n n p và t o dịng thành cơng trong t bào E. coli BL21 (DE3).
4.3. K t qu bi u hi n endolysin tái t h p trong t bào E. coli BL21(DE3)
4.3.1. K t qu bi u hi n endolysin khi c m ng b ng IPTG
K t qu theo dõi giá tr OD600nm khi c m ng bi u hi n endolysin b ng IPTG (hình 4.6) cho th y ngay sau khi c m ng b ng IPTG, đãăxu t hi n hi năt ng t bào vi khu n E. coli BL21 (DE3) b ly gi i t bên trong ra và giá tr OD600nm c a d ch bi u hi n b gi m rõ r t so v iăđ i ch ng.
Hình 4.6. K t qu theo dõi giá tr OD600nm khi c m ng bi u hi n endolysin b ng IPTG.
Nh ăv y, sau khi c m ng b ng IPTG có th đãăgâyăđ c, nh t là bi u hi n protein
cóăneoămàngănh ăendolysin ho c kh n ngăcaoăh năđóălàăendolysin tái t h păđ c
t o ra làm cho t bào E. coli BL21 (DE3) b ly gi i t bên trong ra.
IPTG là ch t có c uătrúcăt ngăt v iăallolactose,ăth ng là ch t c m ngă uă
tiên cho h th ng bi u hi n T7, vì nó là m t ch t c m ng m nh và khơng b chuy n hóa b i t bào [92]. Tuy nhiên, có m t s nh căđi măliênăquanăđ n IPTG, vì nó là m t ch t c m ng m nh nên có th gây gánh n ngătraoăđ i ch t lên các t bào khi
c m ngăvàăc ngăgâyăraănhi u lo i ph n ngăc ngăth ng trong t bào [93]. Do v y,
IPTG có th gâyăđ c cho t bàoătrongătr ng h p này nênăđ tài s d ng lactose thay th . 0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 0 30 60 90 120 150 180 210 240 G iá ătr ăO D 600nm Th iăgiană(phút) IPTG iăch ng
4.3.2. K t qu bi u hi n endolysin khi c m ng b ng lactose
Vi c bi u hi n endolysin s d ng ch t c m ngălactoseăđãăđ c ti n hành v i các n ngăđ lactose khác nhau. K t qu cho th y các nghi m th c c m ng b ng lactose (hình 4.7), vi khu n E. coli BL21 (DE3) v năsinhătr ng bìnhăth ng so v i
đ i ch ngătrongă60ăphútăđ u. Sau 60 phút, OD b tăđ u gi m,ăcóăngh aălàăc ngăcóăhi n
t ng ly gi i t bào t trong nh ngăt căđ th păh năsoăv i khi c m ng b ng IPTG.
Hình 4.7. K t qu theo dõi giá tr OD600nm khi c m ng bi u hi n endolysin b ng lactose.
n ngăđ 5mM lactose, t căđ t ngătr ng c a vi khu n có s th păh năsoăv i các n ngăđ lactoseăđãăkh oăsát.ă i u này có th gi i thích là do n ngăđ này endolysin tái t h p đ c c m ng t o ra và có th đãă c ch nh s sinhătr ng c a
vi khu n E. coli BL21 (DE3). Sau 4h c m ng, d ch bi u hi n đãăđ c thu nh n và ti n hành ly tâmăđ thu t bào.ăSauăđóăti n hành phá v t bào b ng sóng siêu âm.
Dchăendolysinăthơăsauăđóăđ c thu nh n và ti năhànhăđi n di SDS-PAGEăđ ki m
tra quá trình bi u hi n endolysin cell wall hydrolase tái t h p trong t bào E. coli BL21 (DE3). K t qu đi n di SDS-PAGE (hình 4.8) cho th y gi ng s 2 (có c m ng b ng lactose) xu t hi n v ch protein 20 kDa và gi ng 1 (không c m ng
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000 0 30 60 90 120 150 180 210 240 G ía ătr ăO D 600nm Th iăgiană(phút) iăch ng 0.5mM 1mM 2mM 5mM
lactose)ăc ngăcóăxu t hi n v ch protein 20 kDa, tuy nhiên ch tăl ng tách v ch
proteinăch aăt t nên m căđ bi u hi năendolysinăcóăv t m căhayăkhơngăch aăth
đánhăgiáăđ c ch c ch n. Lu năv năc n các nghiên c uăthêmăđ t iă uăvi c bi u hi n
endolysin cell wall hydrolase, th c hi năph ngăphápăwesternăblotăđ kh ngăđnh s hi n di n c a protein endolysin cell wall hydrolase. Nh ăph m vi nghiên c u c a lu n
v n,ăđíchăđ n c a lu năv nănàyălàăho t tính enzyme tái t h p,ădoăđóănh ng n i dung
này s đ c th c hi n trong nh ng nghiên c u k ti p.
Hình 4.8. K t qu đi n di SDS-PAGE sau khi bi u hi n và thu h i endolysin tái t h p.
Chú thích hình 4.8:
Gi ng 1: D ch phá t bào E. coli BL21 (DE3)-pET28a (+)-cell wall hydrolase không c m ng;
Gi ng 2: D ch phá t bào E. coli BL21 (DE3)-pET28a (+)-cell wall hydrolase có c m ng 5mM lactose;
Gi ng 3: D ch phá t bào có c m ng sau khi qua c t (không bám c t);
Gi ngă4:ăPhânăđo n sau khi r a;
Gi ngă5:ăPhânăđo n r a gi i 3.
4.4. K t qu thu h i endolysin tái t h p b ng c t Ni-NTA
Endolysin tái t h păđãăđ c thu h i b ng c t HisPur™ăNi-NTA Spin Columns t endolysin tái t h p thô. Tuy nhiên, k t qu đi n di SDS-PAGE (hình 4.8) cho th y
vi c thu h i endolysin tái t h p v năch aăthànhăcông.ăQuanăsátă gi ng s 3 cho th y v ch protein endolysin 20 kDa v n có xu t hi n d ch sau khi qua c t. Vì khơng có thí nghi măwesternăblotănênăch aărõăv ch 20 kDa này có ch a endolysin tái t h p không. Gi ng s 5 c aăphânăđo n th 3 sau r a gi i t c t Ni-NTA khơng có v ch 20 kDa. Endolysin tái t h păch aăb t lên c t Ni-NTA có th do hai nguyên nhân. Th nh t là hàm l ngăproteinăđíchăqăítăvìăkhơngăđ c bi u hi năv t m c nên 1ml m u khi n p c tălàăkhôngăđ . Th hai, vì endolysin tái t h p có th xuyên màng t bào vi khu n và khi phá v t bào, t o d ng vesicle nên có th điăHis-tag c a endolysin n m bên trong vesicle không th liên k t v i c t Ni-NTA. i v iătr ng h p th nh t có th t ngăl ng m u n p.ă i v iătr ng h p hai, c n th c hi n các kh o sát dùng các tác nhân phá màng t bàoănh ăTritonăX-100 ho c Triton X-114 [94] tr c khi n p m u lên c t.
Doăch aăcóăcácăthíănghi măđánhăgiá hàmăl ng protein bi u hi nătr c và sau
khi tinh s ch nênăch aăđánhăgiáăhi u su t thu h i.
4.5. K t qu kh o sát ho t tính kháng vi khu n Aeromonas hydrophila c a d ch endolysin tái t h p thô endolysin tái t h p thô
Ho t tính kháng vi khu n A. hydrophila c a d ch endolysin tái t h p thô đãă đ c kh o sát b ngăph ngăphápăspotătestă(đánhăgiáăkh n ngălyăgi i t bên ngoài)
vàăph ngăphápăđ m khu n l c (đánhăgiáăkh n ngă c ch sinhătr ng t bào).
K t qu kh o sát ho t tính ly gi i A. hydrophila c a d ch endolysin tái t h p thơ
K t qu (hình 4.9) cho th y nghi m th c d ch endolysin thơ khơng pha lỗng (s 1) có xu t hi n vòng ly gi i vi khu n A. hydrophila, các nghi m th c d ch endolysin thô các t l phaălỗngăkhácăđ u khơng xu t hi n vịng ly gi i. K t qu này cho th y d ch endolysin thơ có ho t tính ly gi i y u vi khu n A. hydrophila.
Hình 4.9. K t qu kh o sát ho t tính ly gi i vi khu n A. hydrophila c a d ch endolysin tái t h p thô b ngăph ngăphápăspotătest.
Chú thích hình 4.9:
( C): dch đ m (đ i ch ng);
(1): d ch endolysin tái t h p thơ khơng pha lỗng;
(1/2), (1/4), (1/8) và (1/16): d ch endolysin tái t h p thô các đ pha loãng 1/2, 1/4, 1/8 và 1/16.
K t qu ho t tính kháng vi khu n A. hydrophila c a d ch endolysin tái t h p thô
K t qu đ m khu n l c m cătrênăđ aăth ch cho th y nghi m th c s d ng