CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.3. Đánh giá một số đặc tính tiểu phân niosome vitami nC
2.4.3.1. Hình thức hỗn dịch niosome.
Đánh giá bằng cảm quan: niosome vitamin C tạo thành phải là hỗn dịch trắng đục, đồng nhất, khơng có các tiểu phân lớn có thể quan sát bằng mắt thường.
2.4.3.2. KTTP và phân bố KTTP PDI
KTTP và chỉ số đa phân tán PDI là các thông số quan trọng trong việc kiểm tra sự phù hợp của kích cỡ tiểu phân và sự ổn định của chế phẩm, đặc biệt trong hệ niosome. Chính vì thế các thơng số này ln được xem xét trong quá trình bào chế, sản xuất và bảo quản.
Thiết bị sử dụng: máy Zetasizer ZS 90
Nguyên tắc của phép đo: Kích thước hạt được đo dựa trên sự khuếch tán ánh sáng cho phép đo những dao động tạm thời (tán xạ ánh sáng động-Dynamic Light Sacttering) của cường độ giao thoa theo một hướng cố định (nhìn chung ở một góc tán xạ 90 độ so với tia tới). Những dao động này là kết quả của chuyển động Brown của các tiểu phân trong môi trường phân tán.
Tiến hành: Pha loãng mẫu thử 5-10 lần với nước cất đã lọc qua màng cellulose acetat 0,2um sao cho số lượng photon phát hiện mỗi giây (count rate) đạt giá trị 200- 400 (Kcps). Tiến hành đo chỉ số đa phân tán PDI, KTTP của hỗn dịch niosome bằng thiết bị Zetasizer NanoZ90, sử dụng cuvet nhựa trong suốt.
Đánh giá kết quả: ZAverager, PDI. Trong đó, chỉ số ZAverager ( đơn vị đo “d.nm”: số nanomet đường kính tiểu phân) gần tương đương với KTTP trung bình của mẫu khi giá trị PDI nhỏ (0-0,3) và dùng đề so sánh về kích thước giữa các mẫu niosome khác nhau. Khi PDI lớn (>0,5) thì chỉ số ZAverager khơng có ý nghĩa, dựa vào vị trí các peak trên đồ thị phân bố để so sánh kích thước giữa các mẫu.
2.4.3.3. Phương pháp định lượng vitamin C a. Phương pháp quang phổ hấp thụ
Xác định bước sóng hấp thụ cực đại
Pha dung dịch vitamin C có nồng độ khoảng 10 μg/ml trong dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5, tiến hành quét phổ dung dịch thu được bằng máy đo quang ở dải
19
bước sóng 200-400nm. Từ hình ảnh phổ hấp thụ thu được xác định được bước sóng có độ hấp thụ lớn nhất.
Khảo sát mối tương quan giữa nồng độ vitamin C và mật độ quang.
Cân chính xác 25mg vitamin C hịa tan vào bình định mức 100ml bằng dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5, định mức vừa đủ 100ml thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 250 μg/ml. Từ dung dịch trên tiến hành pha loãng thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 1 μg/ml, 2 μg/ml, 4 μg/ml, 6 μg/ml, 8 μg/ml và 10 μg/ml bằng dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5. Tiến hành đo độ hấp thụ quang của dãy dung dịch trên với mẫu trắng là dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5. Từ đó xây dựng được đường chuẩn tuyến tính biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thu quang và nồng độ vitamin C trong dung dịch.
y=ax+b Trong đó.
y: độ hấp thu quang của dung dịch vitamin C x: nồng độ dung dịch vitamin C
a, b: hệ số phương trình
Đánh giá sự ảnh hưởng của tá dược đến độ hấp thụ quang của vitamin C
Khảo sát độ hấp thụ quang của Span 60 và vitamin E tại bước sóng hấp thụ cực đại của vitamin C trong môi trường đệm citro phosphat pH 6,5, đánh giá ảnh hưởng của tá dược đến phép định lượng vitamin C bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV- VIS.
Tiến hành: Bào chế mẫu niosome trắng (không chứa dược chất) theo quy trình
bào chế niosome vitamin C. Hịa tan màng niosome bằng 25ml ethanol tuyệt đối, pha lỗng thích hợp bằng dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5, quét phổ thu được trong khoảng bước sóng 200-400, mẫu trắng là đệm citro phosphat pH 6,5.
b. Phương pháp HPLC định lượng vitamin C
Tham khảo quy trình của Lương Trần Thanh Huyền [3] , sử dụng phương pháp HPLC định lượng vitamin C theo quy trình.
- Pha tĩnh: Cột Hypersil™ BDS C8, kích thước 4,6 x 150 mm, kích thước hạt 5μm.
- Pha động: Hỗn hợp methanol : dung dịch dinatriphosphast 80mM tỉ lệ 3:7 (v/v) (dung dịch đệm được điều chỉnh đến pH 7,8 bằng dung dịch NaOH 10% hoặc acid orthophossphoric (nếu cần), lọc qua màng cellulose acetat 0,45μm bằng thiết bị lọc nén, siêu âm 15 phút để loại bỏ hồn tồn bọt khí).
20 - Thể tích tiêm mẫu: 20uL
- Detector tử ngoại λ =278nm
- Dung dịch pha loãng mẫu: Nước tinh khiết được điều chỉnh đến pH 2,5 bằng acid orthophosphoric (nếu cần).
- Mẫu thử: 1ml dung dịch vitamin C đã được xử lý và pha loãng đến nồng độ thích hợp, lọc qua màng cellulose acetat 0,45μm.
Thẩm định một số chỉ tiêu phương pháp HPLC
Tính thích hợp hệ thống
Cân chính xác khoảng 25 mg vitamin C, pha trong bình định mức 100ml bằng dung dịch pha loãng mẫu, thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ 250µg/ml. Từ dung dịch trên, tiến hành pha loãng thu được dung dịch có nồng độ 10 μg/ml. Tiến hành chạy sắc ký theo điều kiện được mô tả như trên. Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn này, ghi lại sắc ký đồ.
Yêu cầu: chênh lệch diện tích pic (Spic) và thời gian lưu (tR) giữa các lần tiêm của
cùng một mẫu, biểu thị độ chênh lệch tương đối %RSD khơng được lớn hơn 2%.
Tính tuyến tính
Tiến hành pha lỗng dung dịch chuẩn gốc nồng độ 250µg/ml bằng dung dịch pha lỗng mẫu thu được một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 2; 5; 10; 15; 25 µg/ml. Dãy dung dịch này được đem đi chạy HPLC với các điều kiện được mô tả như trên, từ đó xây dựng được đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ dược chất.
2.4.3.4. Đánh giá hiệu suất niosome hóa
Hiệu suất niosome hóa được xác định gián tiếp thơng qua định lượng dược chất tự do và lượng dược chất tồn phần có trong hệ bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS.
a. Định lượng vitamin C tồn phần trong hỗn dịch niosome
Mẫu thử: Hút chính xác 1ml hỗn dịch niosome vitamin C chưa tinh sạch chuyển vào bình định mức 25ml, định mức vừa đủ bằng ethanol tuyệt đối, tiến hành đem siêu âm 15 phút để đảm bảo các thành phần trong hệ được hịa tan hồn tồn sau đó pha lỗng đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5
Mẫu chuẩn: Dung dịch vitamin C chuẩn nồng độ 5 μg/ml được hịa tan trong mơi
trường đệm citro phosphat pH 6,5.
Mẫu trắng: Dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5
Tiến hành đo độ hấp thu quang của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng ở λmax quét được, ghi lại giá trị A tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn. Dựa trên độ hấp thụ A
21
của mẫu thử và mẫu chuẩn để tính ra lượng dược chất tồn phần có trong hệ niosome theo cơng thức:
Ct= 𝐴𝑡
𝐴𝑐×Cc × 𝑘
𝑘,
Trong đó:
At, Ac: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn Ct, Cc: nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn (μg/ml) k, k’: hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn
b. Định lượng vitamin C tự do.
Mẫu thử: Hút chính xác 1ml hỗn dịch niosome chưa tinh sạch cho vào phần thân
của ống siêu lọc Amicon® Ultra-4, tiến hành ly tâm lạnh ở 5000 vịng/phút, nhiệt độ 15 độ C trong khoảng 20 phút. Hút lấy phần dịch trong ở đáy ống , pha loãng đến nồng độ thích hợp trong khoảng tuyến tính bằng đệm citro phosphat pH 6,5.
Mẫu chuẩn: Dung dịch vitamin C chuẩn nồng độ 5 μg/ml được hòa tan trong môi
trường đệm citro phosphat pH 6,5.
Mẫu trắng: Dung dịch đệm citro phosphat pH 6,5.
Tiến hành đo độ hấp thu quang của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng ở λmax quét được, ghi lại giá trị A tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn. Dựa trên độ hấp thụ A của mẫu thử và mầu chuẩn để tính ra lượng dược chất tự do có trong hệ niosome theo cơng thức:
Ct= 𝐴𝑡
𝐴𝑐×Cc × 𝑘
𝑘,
Trong đó:
At, Ac: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn Ct, Cc: nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn (μg/ml) k, k’: hệ số pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn
c. Cơng thức tính
✓ Hiệu suất nạp vitamin C (EE, %) được tính theo cơng thức:
EE = (1- 𝑉𝑖𝑡 𝐶𝑡ự 𝑑𝑜
𝑉𝑖𝑡 𝐶𝑡𝑜à𝑛 𝑝ℎầ𝑛)×100% = (1-𝐶𝑡′
𝐶𝑡) ×100% Trong đó:
EE: hiệu suất nạp dược chất
22
✓ Khối lượng vitamin C khơng được niosome hóa được tính theo cơng thức.
mVit C tự do = 𝑚𝑉𝑖𝑡 𝐶 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢 ×𝐸𝐸
100
Trong đó:
EE: hiệu suất nạp dược chất (%)
mVit C ban đầu: khối lượng vitamin C đã cân để làm mẫu (g). mVit C tự do: khối lượng vitamin C khơng được niosome hóa (g).
✓ Đánh giá tỉ lệ dược chất trong niosome so với tổng tá dược dầu (LC, %)
LC= 𝑚𝑉𝑖𝑡 𝐶 𝑏𝑎𝑛 đầ𝑢−𝑚𝑉𝑖𝑡 𝐶 𝑡ự 𝑑𝑜
𝑚𝑆𝑝𝑎𝑛 60 + 𝑉𝑖𝑡𝑎𝑚𝑖𝑛 𝐸 ×100%
Trong đó:
LC: khả năng nạp dược chất (%)
mVit C ban đầu: khối lượng vitamin C đã cân để làm mẫu (g). mVit C tự do: khối lượng vitamin C không được niosome hóa (g).
mSpan 60 + Vitamin E: tổng khối lượng tá dược dầu đã cân để làm mẫu (g).