CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.3. Phương pháp phân lập hợp chất
2.5.3.1. Phân lập bằng sắc ký cột
Trước khi tiến hành phân lập chất, khảo sát cao phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn pha động tối ưu nhất. Các bước tiến hành sắc ký cột:
Lựa chọn chất nhồi cột (pha tĩnh):
Với sắc ký cột silica gel pha thường: Silica gel cỡ hạt 0,040 0,063 mm
(Merck).
Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Silica gel pha đảo 75 μm YMC Co., Ltd, Nhật.
Lựa chọn dung môi rửa giải (pha động): Hỗn hợp được pha từ các dung môi thường dùng: n-hexan, dicloromethan, ethyl acetat, methanol, nước với tỷ lệ thích hợp đã được khảo sát bằng TLC.
Xác định khối lượng mẫu cần lên cột.
Chuẩn bị mẫu:
Với sắc ký cột silica gel pha thường: Mẫu được hịa tan hồn tồn trong một thể tích dung mơi tối thiểu. Sau đó, trộn đều với một lượng silica gel vừa đủ, bay hơi hết dung môi đến khi thu được bột khơ tơi. Nếu có các hạt vón cục, có thể nghiền mịn lại bằng chày cối sứ.
Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Hòa tan lượng cao cần lên cột với một lượng methanol tối thiểu, thu được dung dịch mẫu. Nếu xuất hiện kết tủa, có thể lựa chọn dung mơi khác có khả năng hịa tan mẫu tốt hơn, hoặc lọc và xử lý riêng phần tủa.
Chuẩn bị cột thủy tinh có khóa, đường kính và chiều dài phù hợp với lượng mẫu đưa lên cột, rửa sạch, tráng bằng aceton rồi để khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định. Lót một lượng bơng vừa phải ở phần thân cột ngay phía trên vịi thốt (tránh lót q nhiều bơng gây tắc cột).
Nhồi cột:
Với sắc ký cột silica gel pha thường: Cân một lượng silica gel phù hợp với lượng mẫu cần lên cột. Hòa lượng silica gel trên với lượng dung môi rửa giải thích hợp trong cốc có mỏ thu được hỗn dịch dung môi silica gel
mở khóa cột (cố gắng đưa tồn bộ khối hỗn dịch này vào cột bằng một lần rót duy nhất). Hứng dung môi đồng thời liên tục bổ sung dung môi vào cột trong khoảng thời gian thích hợp để ổn định lớp silica gel trong cột.
Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Cân một lượng silica gel pha đảo phù hợp với lượng mẫu đưa lên cột. Hòa lượng silica gel trên với methanol trong cốc có mỏ, khuấy đều, thu được hỗn dịch MeOH silica gel tương đối loãng.
Vừa khuấy đều vừa rót hỗn dịch này vào cột đã chuẩn bị, mở khóa cột (cố gắng đưa tồn bộ khối hỗn dịch này vào cột bằng một lần rót duy nhất). Hứng dung mơi đồng thời liên tục bổ sung dung môi vào cột trong khoảng thời gian thích hợp để ổn định lớp silica gel trong cột.
Nạp mẫu:
Với sắc ký cột silica gel pha thường: Phương pháp nạp mẫu dạng bột khô. Rắc đều mẫu lên lớp dung môi vừa đủ ở đỉnh cột. Đảm bảo lớp dung môi ở đỉnh cột trước khi cho mẫu vào phải hơi dư so với khả năng hút dung môi của bột mẫu để tránh cột bị nứt đỉnh. Cho một lớp bông vừa phải lên mặt thống của dung mơi để bảo vệ bề mặt cột, hạn chế việc mẫu bị xáo trộn khi nạp thêm dung môi.
Với sắc ký cột silica gel pha đảo: Phương pháp nạp mẫu dạng dung dịch. Dùng pipet đủ dài đưa nhẹ nhàng dung dịch mẫu vào lớp dung môi chừa trên đỉnh cột (1 2 cm) để toàn bộ dịch mẫu thấm đều vào chất hấp phụ.
Rửa giải: Cho dung môi rửa giải thích hợp vào cột đã được nạp mẫu. Bổ sung dung môi thường xuyên, đảm bảo mức dung môi luôn cao hơn mẫu trong cột.
Hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm hoặc bình nón có dung tích phù hợp.
Theo dõi sắc ký đồ của các ống hứng bằng TLC để gộp phân đoạn.
2.5.3.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Nguyên tắc: Dựa trên cơ chế hấp phụ. Chất phân tích được chấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định. Tùy thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của các thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vết sắc ký ở các vị trí khác nhau.
Trong khóa luận, sắc ký lớp mỏng được sử dụng để lựa chọn hệ dung môi pha động trước khi lên cột và theo dõi quá trình rửa giải trong quá trình chạy cột.
Bản mỏng: Thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường (TLC-Silica gel 60 F254, Merck) và pha đảo RP-18 F254S (Merck), được hoạt hóa bằng cách sấy ở 110ºC trong 30 phút.
Dung môi pha động: Sử dụng hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo một tỷ lệ thích hợp.
Phát hiện các hợp chất bằng cách quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc nhúng bản mỏng trong dung dịch acid sulfuric
10% trong ethanol (TT), sấy khơ rồi hơ nóng đến khi hiện vết màu.