STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận
1 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy lọc ++ Có 2 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đặc ++ Có 3 Phytosterol Phản ứng Liebermann – Burchard ++ Có
4 Saponin Phản ứng tạo bọt ++ Có Phản ứng Salkowski + 5 Coumarin Phản ứng mở đóng vịng lacton - Khơng có Phản ứng Diazo hóa - 6 Flavonoid Phản ứng cyanidin - Có Phản ứng với dd FeCl3 5% + Phản ứng với kiềm ++
7 Acid hữu cơ Phản ứng với tinh thể Na2CO3 - Khơng có
8 Acid amin Phản ứng với ninhydrin ++ Có
9 Tanin
Phản ứng với FeCl3 5% +
Khơng có Phản ứng với chì acetat 10% ++
Phản ứng với gelatin 1% -
10 Đường khử tự do Phản ứng với TT Fehling A/B ++ Có
11 Alcaloid
Phản ứng với TT Mayer -
Khơng có Phản ứng với TT Bouchardat -
Phản ứng với TT Dragendorff -
12 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Khơng có
Chú thích: (-): Phản ứng âm tính, (+): Phản ứng dương tính, (++): Phản ứng dương tính rõ
Nhận xét: Qua các phản ứng định tính, sơ bộ thấy trong thân và lá Chè vằng chứa
chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, flavonoid, đường khử tự do và acid amin.
3.2. Kết quả chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất
3.2.1. Kết quả chiết xuất và phân lập
Thân và lá cây Chè vằng đã được thái nhỏ, sấy khô (7,5 kg, độ ẩm 11,55%), đem ngâm chiết với ethanol 80% ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ DL/DM = 1:8 (kg/l) × 3 lần, mỗi lần chiết kéo dài trong vòng 3 ngày. Kết thúc 3 lần chiết, lọc loại bỏ bã dược liệu, dịch
chiết được gộp lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm rồi làm khô trong tủ hút thu được cao tổng (1,2 kg, độ ẩm 22,76%).
Cao tổng được phân tán trong một lượng nước nóng tối thiểu, sau đó tiến hành chiết lỏng lỏng lần lượt với dung môi n-hexan, DCM và EtOAc trong bình gạn thủy tinh (3 lần, tỷ lệ dung môi 1:1, v/v), thu được dịch chiết các phân đoạn n-hexan, DCM và EtOAc. Thu hồi dung môi bằng máy cô quay chân không thu được cao n-hexan (63,0 g),
DCM (100,0 g), cao EtOAc (35,0 g) và cắn nước (882,0 g). Quy trình chiết xuất được thể hiện qua Hình 3.1.
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ thân và lá Chè vằng
Cao EtOAc (35,0 g) sau khi lưu mẫu (1,6 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng dung môi 100% DCM, DCM MeOH (9:1, 7:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v) và 100% MeOH thu được 7 phân đoạn ký hiệu là E1 E7.
Chiết với DCM × 3 lần, tỷ lệ dung mơi 1:1 (v/v) 1. Thái nhỏ, sấy khơ dược liệu
2. Chiết với EtOH 80% × 3 lần (phương pháp ngâm lạnh), tỷ lệ DL/DM = 1:8 (kg/l)
Chiết với n-hexan × 3 lần, tỷ lệ dung môi 1:1 (v/v)
Cao n-hexan (63,0 g) Cao DCM (100,0 g) Lớp nước Thân, lá Chè vằng (7,5 kg) Dịch chiết ethanol Cao tổng (1,2 kg)
Thu hồi dung mơi
Dịch nước
Phân tán trong nước nóng
Lớp nước
Thu hồi dung môi
Cao EtOAc
(35,0 g)
Cắn nước
(882,0 g)
1. Chiết với EtOAc × 3 lần, tỷ lệ dung môi 1:1 (v/v)
2. Thu hồi dung môi Thu hồi dung môi
Tiếp tục phân lập phân đoạn E3 (4,3 g) bằng sắc ký cột silica gel, rửa giải bằng hệ dung môi gradient EtOAc MeOH H2O (90:9:1 70:25:5, v/v/v) và 100% MeOH thu được 5 phân đoạn ký hiệu là E3.1, E3.2, E3.3, E3.4, E3.5.
Tinh chế phân đoạn E3.2 (88,0 mg) bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-C18 với hệ dung môi rửa giải aceton nước (1:2, 1:1, v/v), thu được hợp chất JS1 (12,0 mg).
Tinh chế phân đoạn E3.3 (100,0 mg) bằng sắc ký cột silica gel pha đảo RP-C18, rửa giải bằng hệ dung môi MeOH H2O (1:1, v/v), thu được hợp chất JS2 (10,0 mg).
Sắc ký đồ của các hợp chất phân lập so với cao tổng, cao EtOAc, phân đoạn E3 được thể hiện qua Hình 3.2.
(A) (B)
Hình 3.2. Sắc ký đồ của các hợp chất phân lập
A: Sắc ký đồ pha đảo với hệ dung môi methanol nước (1:2, v/v) dưới ánh sáng tử ngoại
ở bước sóng 254 nm.
B: Sắc ký đồ pha đảo với hệ dung môi methanol nước (1:2, v/v) sau khi nhúng dung
dịch acid sulfuric 10% trong ethanol (TT) rồi hơ nóng, quan sát dưới ánh sáng thường.
JST: Cao tổng ethanol 80%. JSE: Cao EtOAc.
E3: Phân đoạn E3.
JS1, JS2: Các hợp chất phân lập được.
Hình 3.3. Sơ đồ quy trình phân lập hai hợp chất JS1 và JS2 3.2.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập 3.2.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập
3.2.2.1. Hợp chất JS1
Hợp chất JS1 thu được dưới dạng bột màu nâu nhạt. Phổ 1H-NMR (600 MHz, CD3OD) và phổ 13C-NMR (150 MHz, CD3OD): Xem Bảng 3.2.
Phổ 1H-NMR của JS1 xuất hiện 3 tín hiệu proton aromatic của hệ ABX tại δH 6,81 (1H, d, J = 7,8 Hz), 7,45 (1H, d, J = 1,8 Hz) và 7,43 (1H, dd, J = 1,8; 7,8 Hz). Phổ 13C- NMR xuất hiện 7 tín hiệu carbon trong đó có 1 carbon carboxylic (δC 170,2), 3 carbon không liên kết với hydro (δC 123,1; 146,1 và 151,5) và 3 carbon methin (δC 115,8; 117,7 và 123,9), cũng cho thấy sự xuất hiện của hệ ABX trong cấu trúc của JS1. Phổ khối ESI- MS (Phụ lục 3.3) của JS1 cho pic ion giả phân tử tại m/z 153,10 [M-H]-, phù hợp với công thức phân tử C7H6O4. Từ những phân tích trên kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [62], có thể xác định JS1 là acid protocatechuic (Hình 3.4).
Cao EtOAc (33,4 g) SKC silica gel 100% DCM, DCM MeOH (9:1, 7:1, 5:1, 3:1, 1:1, v/v), 100% MeOH E1 E2 E3 (4,3 g) E4 E7 SKC silica gel
EtOAc MeOH H2O (90:9:1 70:25:5, v/v/v), 100% MeOH JS1 (12,0 mg) JS2 (10,0 mg) E3.1 E3.2 (88,0 mg) E3.3 (100,0 mg) E3.4 E3.5
SKC silica gel pha đảo RP-C18