3.3. Bàn luận
3.3.1. Về kết quả định tính
Kết quả định tính các nhóm chất thường gặp bằng các phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy thân và lá Chè vằng chứa chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, flavonoid, đường khử tự do và acid amin. Phương pháp này đơn giản, dễ thao tác, phù hợp với nhiều mẫu nghiên cứu trong điều kiện phịng thí nghiệm.
Kết quả định tính giúp phân tích sơ bộ thành phần hóa học có trong thân và lá Chè vằng, từ đó là cơ sở định hướng cho việc chiết xuất và phân lập các hợp chất hóa học từ lồi cây này.
3.3.2. Về kết quả chiết xuất
Phương pháp dùng để chiết dược liệu là phương pháp ngâm lạnh (ngâm ở nhiệt độ phịng) với dung mơi chiết là EtOH 80%, tỷ lệ DL/DM = 1:8 (kg/l) × 3 lần, mỗi lần chiết kéo dài trong vòng 3 ngày. Việc lựa chọn phương pháp ngâm lạnh vì phương pháp này có những ưu điểm sau:
Quy trình và dụng cụ đơn giản, ít tốn kém, phù hợp với quy mơ phịng thí nghiệm.
Thích hợp với nhiều loại dược liệu và nhiều loại dung môi.
Hạn chế sự phân hủy các hoạt chất kém bền với nhiệt.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhiều hạn chế như thao tác thủ công, tốn thời gian, dịch chiết loãng do chiết nhiều lần gây tốn dung môi, hiệu suất thấp hơn so với các phương pháp khác như chiết hồi lưu, ngấm kiệt, soxhlet,… Do đó, quy trình chiết xuất đã thực hiện các biện pháp nhằm tăng hiệu suất chiết như: (1) Thái nhỏ, sấy khô thân và lá Chè vằng trước khi chiết, làm tăng diện tích tiếp xúc giữa dung mơi và dược liệu; (2) Thi thoảng có khuấy trộn hỗn hợp chiết để tăng chênh lệch nồng độ hoạt chất ở bề mặt phân cách pha; (3) Tỷ lệ DL/DM phù hợp. Ngoài ra, việc lựa chọn dung môi chiết xuất cao tổng là ethanol 80% là vì những nguyên nhân sau:
Theo cuốn "Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ" (2007), tác giả Nguyễn Thị Kim Phụng đã đề cập rằng: "Khi cần phải chiết lấy tồn bộ các hợp chất có trong bột
cây, các nhà hóa học các hợp chất thiên nhiên thường hay sử dụng dung môi là alcol 80% (ethanol, methanol), vì loại dung mơi này có khả năng thẩm thấu xun qua màng tế bào thực vật, cũng như có thể tạo nối hydrogen liên phân tử với các nhóm phân cực khác, nên được xem là dung môi vạn năng, có thể chiết được cả các hợp chất có độ phân cực mạnh, vừa và yếu" [9], dẫn đến tăng hiệu suất chiết.
Nhiệt độ sôi của ethanol thấp hơn so với nước, thuận lợi khi cô thu hồi dung môi, giảm sự phân hủy các hoạt chất trong dịch chiết.
Ethanol có tác dụng bảo quản, hạn chế nhiễm khuẩn so với dung mơi nước, do đó có thể ngâm dược liệu trong nhiều ngày.
Từ những ưu điểm trên mà khóa luận đã chọn ethanol 80% là dung mơi chiết xuất thay vì dung mơi nước (vốn là dung môi được người dân dùng để sắc Chè vằng uống trong đời sống hằng ngày).
Từ cao tổng, tiến hành chiết lỏng lỏng lần lượt với các dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, DCM và EtOAc, thu hồi dung môi thu được các cao phân đoạn tương ứng.
3.3.3. Về kết quả phân lập các hợp chất
Khóa luận tiến hành phân lập các hợp chất hóa học bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển vì phương pháp này sử dụng thiết bị, dụng cụ đơn giản hơn so với các phương pháp sắc ký cột cải tiến, phù hợp quy mơ phịng thí nghiệm. Khảo sát các vết hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng với mục đích lựa chọn hệ dung môi pha động tối ưu và theo dõi q trình rửa giải.
Khóa luận lựa chọn phân đoạn Ethyl acetat để phân lập chất vì lý do sau: Dựa vào tổng quan hóa học về cây Chè vằng cho thấy nhóm hợp chất chính có trong cây Chè vằng là các hợp chất phenylethanoid glycosid và flavonoid. Hai nhóm chất này có mặt trong phân đoạn ethyl acetat.
Từ phân đoạn EtOAc của dịch chiết cao tổng EtOH 80% đã phân lập được hai hợp chất là JS1 và JS2. Dựa trên đặc điểm về tính chất lý hóa, khối phổ, phổ cộng hưởng từ
hạt nhân, so sánh với các dữ liệu đã được công bố, xác định được hai hợp chất JS1 và JS2 lần lượt là acid protocatechuic và verbascosid.
3.3.3.1. Về hợp chất JS1 (acid protocatechuic, PCA)
Acid protocatechuic (acid 3,4-dihydroxybenzoic) là một acid phenolic tự nhiên được tìm thấy trong nhiều loài thảo dược. PCA có nguồn gốc từ loài Bụp giấm (Hibiscus
sabdariffa) [79]. Hợp chất này đã được phân lập từ thân và lá Chè vằng trong một nghiên
cứu năm 2012 [10]. Ngồi ra, PCA cịn được báo cáo có trong các lồi khác thuộc chi
Jasminum như J. nudiflorum, J. azoricum, J. humile, J. muliflorum, J. officinale, J. sambac [47]. Acid protocatechuic có nhiều tác dụng sinh học đã được chứng minh như:
PCA có tác dụng chống oxy hóa [25], [48], [82], [89]. Trong một thử nghiệm in vitro, acid protocatechuic cho thấy hoạt động chống oxy hóa hiệu quả hơn nhiều so với
Trolox ở cả môi trường lipid và nước. Do đó, hợp chất này có thể được sử dụng trong ngành dược hoặc cơng nghiệp thực phẩm như một chất chống oxy hóa tự nhiên [48].
Một số nghiên cứu của Wen-hu Liu và cộng sự cho thấy acid protocatechuic thể hiện hoạt tính kháng khuẩn in vitro đối với các chủng vi khuẩn như Staphylococcus aureus
kháng methicillin (MRSA), Klebsiella pneumoniae, Helicobacter pylori, Pseudomonas
aeruginosa [51], [79]. Nhiều nghiên cứu khác cũng chứng minh rằng acid protocatechuic
có tác dụng kháng khuẩn [24], [38], [45], [52], [87].
Trong một nghiên cứu năm 2006, các thử nghiệm về độc tính tế bào cho thấy acid protocatechuic ở nồng độ 100 μmol/L đã tiêu diệt hiệu quả các tế bào ung thư biểu mô tế bào gan Hep-G2 [88]. Tác dụng chống ung thư của PCA cũng đã được chứng minh trong nhiều nghiên cứu khác [49], [57], [76].
Năm 2011, Amol B. Lende và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm đánh giá hoạt động chống viêm của acid protocatechuic trên chuột. Kết quả là PCA gây ra sự ức chế đáng kể các tình trạng như phù chân sau, sự hình thành u hạt và chỉ số viêm khớp trong phù do carrageenan. Ngoài ra, PCA cũng tạo ra hoạt động giảm đau đáng kể ở chuột bằng phương pháp đĩa nóng, điều này rất có lợi vì đau là một triệu chứng thường đi kèm với quá trình viêm [46].
Ngoài các tác dụng sinh học được nhắc đến ở trên, acid protocatechuic còn được biết đến với nhiều tác dụng có lợi khác như:
Tác dụng bảo vệ tế bào gan [50], [80].
Tác dụng chống đái tháo đường [32], [68], [69].
Tác dụng chống xơ vữa động mạch [83].
3.3.3.2. Về hợp chất JS2 (verbascosid)
Verbascosid (acteosid) là một phenylethanoid glycosid phổ biến trong tự nhiên. Năm 1963, Scarpati và Delle-Monache lần đầu tiên phân lập được verbascosid từ loài
Verbascum sinuatum và sau đó nghiên cứu về verbascosid đã được phát triển nhanh
chóng [67]. Cho đến nay, verbascosid chủ yếu được tìm thấy ở các loài thuộc chi
Verbascum [15].
Đã có nhiều nghiên cứu phân lập được hợp chất này từ thân và lá Chè vằng [10], [31]. Nhiều nghiên cứu cho thấy verbascosid là một phenylethanoid glycosid có hàm lượng cao nhất trong Chè vằng. Trong đó, theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Hương năm 2009, verbascosid là hợp chất có hàm lượng cao nhất trong cả 6 mẫu Chè vằng thu hái ở TP. HCM, Nghệ An, Hà Tĩnh [7].
Verbacosid đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học mạnh đáng chú ý. Trong đó, chống viêm là một trong những tác dụng sinh học nổi bật của verbascosid [27], [33], [59], [64]. Ngoài ra, trong một nghiên cứu năm 2012 cho thấy verbascosid phân lập từ cây Chè vằng có khả năng chống oxy hóa mạnh hơn cả chất chuẩn quercetin trong thử nghiệm thu dọn gốc tự do DPPH [10].
Một nghiên cứu năm 2002 đã tiến hành đánh giá hoạt động sinh học của verbascosid trên nhóm chuột được tiêm tế bào ung thư hắc tố B16 vào tĩnh mạch. Kết quả cho thấy verbascosid có khả năng ức chế sự di căn ung thư phổi và kéo dài thời gian sống của nhóm chuột nghiên cứu [56]. Tác dụng ức chế các khối u ác tính của verbascosid được chứng minh ở nhiều nghiên cứu khác [84], [93].
Verbascosid có khả năng làm giảm đáng kể quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào thần kinh, trong khi làm tăng nồng độ hydrogen peroxid ngoại bào. Do đó, verbascosid được kết luận là có lợi trong các bệnh thối hóa thần kinh do stress oxy hóa gây ra [72]. Có nhiều tác dụng sinh học khác của verbascosid đã được chứng minh như bảo vệ tim mạch [23], [57], kháng khuẩn [20], [22], [92] và kháng virus [73].
Như vậy, với nhiều tác dụng sinh học có lợi, có thể nói hai hợp chất acid protocatechuic và verbascosid mà khóa luận đã phân lập được từ dược liệu Chè vằng là các hợp chất rất có tiềm năng trong y học.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau thời gian tiến hành nghiên cứu, khóa luận đã thu được những kết quả sau:
1. Kết quả định tính đã sơ bộ kết luận được rằng thân và lá Chè vằng có chứa chất béo, carotenoid, phytosterol, saponin, flavonoid, đường khử tự do và acid amin. 2. Từ phân đoạn EtOAc của dịch chiết cao tổng ethanol 80% đã phân lập được hai
hợp chất: JS1 và JS2.
3. Từ các dữ liệu khối phổ, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, so sánh với các dữ liệu đã được công bố, xác định được JS1 là acid protocatechuic và JS2 là verbascosid. Hai hợp chất này đều đã được phân lập trước đây từ cây Chè vằng (Jasminum
subtriplinerve Blume).
Kiến nghị
Từ kết luận trên, khóa luận đưa ra một vài kiến nghị:
Tiếp tục phân lập các hợp chất trong phân đoạn EtOAc và các phân đoạn cịn lại (n-hexan, DCM) để tìm kiếm các hợp chất khác.
Nghiên cứu tác dụng sinh học của các cao phân đoạn và các hợp chất phân lập được để bổ sung thêm vào cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Chè vằng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ môn Dược liệu (2019), Thực tập Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr. 74-123.
2. Bộ môn Dược liệu (2012), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Trường Đại học Y dược thành phố Hồ Chí Minh, tr. 28-50.
3. Bùi Hồng Quang (2016), Nghiên cứu phân loại họ Nhài (Oleaceae Hoffmanns. &
Link) ở Việt Nam, Hà Nội, tr. 140-142.
4. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung và các cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật
làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 427-
429.
5. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, tr. 121-122.
6. Nguyễn Quỳnh Hương, Nguyễn Thị Hồng Hương (2011), "Góp phần nghiên cứu nicotiflorin trong cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume)", Tạp chí Dược học, 51(3), tr. 27-32.
7. Nguyễn Thị Hồng Hương (2009), Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sắc ký và điện di
mao quản để kiểm nghiệm chất lượng một số hợp chất phenolic trong cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerve Blume., Oleaceae), Luận án Tiến sĩ Dược học, ĐH
Dược Hà Nội, tr. 1-123.
8. Nguyễn Thị Hồng Hương, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ và các cộng sự (2007), "Góp phần nghiên cứu các flavonoid trong cây Chè vằng (Jasminum subtriplinerver Blume)", Tạp chí Dược học, 11, tr. 29-32.
9. Nguyễn Thị Kim Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học
Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr. 21.
10. Nguyễn Thị Thanh Mai (2012), "Khảo sát hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của cây vằng sẻ (Jasminum subtriplinerve Blume)", Science & Technology,
15(T3-2012), tr. 37-44.
11. Nguyễn Viết Thân (2020), Cây thuốc Việt Nam và những bài thuốc thường dùng,
tập III, Nhà xuất bản Y học, tr. 114-116.
12. Viện Dược liệu (2016), Danh lục cây thuốc Việt Nam, tr. 8.
Tiếng Anh
14. Abhipsa V, Manasa M, et al. (2012), "In vitro antibacterial efficacy of selected plant extracts, streptomycin and their combination", Asian Journal of Research in Chemistry, 5(6), pp. 791-793.
15. Alipieva Kalina I, Orhan Ilkay Erdogan, et al. (2014), "Treasure from garden: chemical profiling, pharmacology and biotechnology of mulleins", Phytochemistry
reviews, 13(2), pp. 417-444.
16. Andary Claude, Tahrouch Saida, et al. (1992), "Caffeic glycoside esters from
Jasminum nudiflorum and some related species", Phytochemistry, 31(3), pp. 885-
886.
17. Anh Trieu Tuan, Hao Luu Tu, et al. (2019), "Effect of extraction process on extraction yeild, total polyphenol content and antioxidant activity of Jasminum subtriplinerve", IOP conference series: materials science and engineering, 544(1),
pp. 012027.
18. Anoopkumar AN, Aneesh Embalil Mathachan, et al. (2020), "Exploring the mode of action of isolated bioactive compounds by induced reactive oxygen species generation in Aedes aegypti: a microbes based double-edged weapon to fight
against Arboviral diseases", International Journal of Tropical Insect Science,
40(3), pp. 573-585.
19. Arun Mittal, Satish Sardana, et al. (2016), "Evaluation of wound healing, antioxidant and antimicrobial efficacy of Jasminum auriculatum Vahl. leaves", Avicenna journal of phytomedicine, 6(3), pp. 295.
20. Avila José Guillermo, de Liverant Juliana G, et al. (1999), "Mode of action of Buddleja cordata verbascoside against Staphylococcus aureus", Journal of ethnopharmacology, 66(1), pp. 75-78.
21. Bảo Nguyễn Chí (2016), "Chemical constituents of che vang (Jasminum
subtriplinerve Blume) from quang tri province", Hue University Journal of Science: Natural Science, 116(2), pp.
22. Bazzaz Bibi Sedigheh Fazly, Khameneh Bahman, et al. (2018), "In vitro evaluation of antibacterial activity of verbascoside, lemon verbena extract and caffeine in combination with gentamicin against drug-resistant Staphylococcus aureus and
Escherichia coli clinical isolates", Avicenna journal of phytomedicine, 8(3), pp.
246.
23. Campo Gianluca, Pavasini Rita, et al. (2015), "Platelet aggregation values in patients with cardiovascular risk factors are reduced by verbascoside treatment. A randomized study", Pharmacological Research, 97, pp. 1-6.
24. Chao Che-Yi, Yin Mei-Chin (2009), "Antibacterial effects of roselle calyx extracts and protocatechuic acid in ground beef and apple juice", Foodborne Pathogens and Disease, 6(2), pp. 201-206.
25. Chou Tzung-Han, Ding Hsiou-Yu, et al. (2010), "Inhibition of melanogenesis and oxidation by protocatechuic acid from Origanum vulgare (oregano)", Journal of Natural Products, 73(11), pp. 1767-1774.
26. Dai Do N, Thang Tran D, et al. (2016), "Study on essential oils from the leaves of two Vietnamese plants: Jasminum subtriplinerve CL Blume and Vitex quinata
(Lour) FN Williams", Natural product research, 30(7), pp. 860-864.
27. Dıaz Ana Marıa, Abad Marıa José, et al. (2004), "Phenylpropanoid glycosides from Scrophularia scorodonia: in vitro anti-inflammatory activity", Life sciences,
74(20), pp. 2515-2526.
28. El-Hawary Seham S, El-Hefnawy Hala M, et al. (2019), "Phenolic profiling of different Jasminum species cultivated in Egypt and their antioxidant activity",
Natural product research, pp. 1-6.
29. Gallo Francesca Romana, Palazzino Giovanna, et al. (2006), "Oligomeric secoiridoid glucosides from Jasminum abyssinicum", Phytochemistry, 67(5), pp.
504-510.
30. Geyid Aberra, Abebe Dawit, et al. (2005), "Screening of some medicinal plants of Ethiopia for their anti-microbial properties and chemical profiles", Journal of ethnopharmacology, 97(3), pp. 421-427.
31. Guo Zhi-yong, Li Ping, et al. (2014), "Antioxidant and anti-inflammatory caffeoyl phenylpropanoid and secoiridoid glycosides from Jasminum nervosum stems, a
Chinese folk medicine", Phytochemistry, 106, pp. 124-133.
32. Harini Ranganathan, Pugalendi Kodukkur Viswanathan (2010), "Antihyperglycemic effect of protocatechuic acid on streptozotocin-diabetic rats",
33. Hausmann M, Obermeier F, et al. (2007), "In vivo treatment with the herbal phenylethanoid acteoside ameliorates intestinal inflammation in dextran sulphate sodium-induced colitis", Clinical & Experimental Immunology, 148(2), pp. 373-
381.
34. Hue Ngan Dai, Hoai Ho Thi Cam, et al. (2008), "Bioactivities and chemical constituents of a Vietnamese medicinal plant Che Vang, Jasminum subtriplinerve
Blume (Oleaceae)", Natural product research, 22(11), pp. 942-949.
35. Huong Nguyen Thi Hong, Cu Nguyen Khac Quynh, et al. (2008), "A new phenylpropanoid glycoside from Jasminum subtriplinerve Blume", Journal of Asian natural products research, 10(11), pp. 1035-1038.
36. Hussein Dorria, El-Shiekh Riham A, et al. (2021), "Unravelling the anthelmintic bioactives from Jasminum grandiflorum L. subsp. Floribundum adopting in vitro
biological assessment", Journal of Ethnopharmacology, 275, pp. 114083.
37. Inoue Kenichiro, Tanahashi Takao, et al. (1985), "Two secoiridoid glucosides from
Jasminum mesnyi", Phytochemistry, 24(6), pp. 1299-1303.
38. Jayaraman Premkumar, Sakharkar Meena K, et al. (2010), "Activity and interactions of antibiotic and phytochemical combinations against Pseudomonas aeruginosa in vitro", International journal of biological sciences, 6(6), pp. 556.
39. Jia-Ming SUN, Zhang Hui, et al. (2009), "Analysis of secoiridoid glucosides in