Chú thích: 1,2,3: Lần lượt là các mẫu kiểm chứng lần 1, lần 2, lần 3.
Như vậy, từ kết quả ở Bảng 3.10, điều kiện chiết xuất với nồng độ ethanol là 90%, tỷ lệ DM/DL là 8 ml/g, thời gian chiết là 90 phút, số lần chiết là 3, thực nghiệm cho kết quả gần với dự đốn của phần mềm được chọn. Độ chính xác của hàm lượng BBR đạt 94,73%, độ chính xác của hiệu suất chiết BBR đạt 97,86%.
32
CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN
Chọn hàm lượng và hiệu suất chiết berberin hydroclorid (BBR) trong thiết kế thí nghiệm:
Số lượng các tài liệu về phương thuốc Tan thống phong còn hạn chế. Tuy nhiên trong DĐTQ 2015, chuyên luận Tam diệu hoàn cũng đã quy định chỉ tiêu định lượng BBR, yêu cầu hàm lượng BBR khơng ít hơn 2mg/g (0,2%) tính theo dược liệu Hồng bá [12]. Từ một nghiên cứu định lượng hàm lượng BBR trong cao đặc Tan thống phong, kết quả thu được là hàm lượng BBR trong các mẫu cao đặc Tan thống phong chiết nước nằm trong khoảng 0,20 ± 0,01% và trong các mẫu cao chiết ethanol nằm trong khoảng 0.88 ± 0.06% [10].
Trong phương thuốc Tan thống phong, qn dược chính là vị thuốc Hồng bá có cơng năng thanh nhiệt, táo thấp, giải độc tiêu viêm. Hoạt chất BBR là thành phần chính trong Hồng bá, có tác dụng giảm acid uric máu [24], [38], bảo vệ thận [38], chống viêm do các tinh thể muối urat lắng đọng ở các khớp [22], kháng khuẩn, chống viêm [25],... BBR được dùng như một chất chỉ điểm để kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Hoàng bá và các chế phẩm có thành phần Hồng bá [12]. DĐTQ 2015 quy định hàm lượng berberin hydroclorid (C20H17NO4HCl) trong dược liệu Hồng bá khơng ít hơn 3,0 %, tính theo dược liệu khơ kiệt [12]. Và hàm lượng BBR trong nguyên liệu Hoàng bá nghiên cứu được xác định là 4,96% đạt yêu cầu của DĐTQ 2015. Từ các thí nghiệm được tiến hành, kết quả hàm lượng BBR trong cao đặc Tan thống phong dao động từ 0,77% đến 2,21%, hiệu suất chiết BBR trong khoảng 27,98- 97,84%. Nhận thấy, hoạt chất chiết được với tỷ lệ tương đối cao và phụ thuộc vào sự thay đổi của điều kiện chiết xuất như nồng độ ethanol, tỷ lệ dung môi/ dược liệu, thời gian chiết và số lần chiết,... Chứng tỏ hoạt chất BBR trong cao đặc Tan thống phong là khá ổn định, phản ánh tốt sự phụ thuộc của biến đầu vào và biến đầu ra trong quy trình.
Do vậy, việc nghiên cứu tối ưu hố quy trình chiết xuất phương thuốc Tan thống phong căn cứ vào hàm lượng và hiệu suất chiết BBR là phù hợp.
Chọn kích thước dược liệu Hồng bá để chiết xuất và điều chế cao đặc.
Kết quả khảo sát kích thước vị thuốc Hồng bá cho thấy khi giảm dần kích thước dược liệu từ dạng phiến đến bột < 2mm, hàm lượng và hiệu suất chiết BBR tăng dần. Nguyên ngân là khi kích thước dược liệu q thơ, dung mơi sẽ khó thấm ướt dược liệu và khơng hồ tan hết hoạt chất trong dược liệu. Khi tăng dần độ mịn dược liệu, bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và dược liệu cũng tăng lên, lượng hoạt chất được hồ tan vào dung mơi tăng lên đồng thời giảm thời gian chiết. Tuy nhiên khơng nên chọn kích thước dược liệu q mịn vì bột dược liệu dễ bị bết dính vào nhau, vón cục và bị bít tắc khi lọc.
33
Tam diệu thang thường được dùng dưới dạng thuốc sắc [1], [3] hoặc thuốc hoàn nước [12], cho thấy trong một giới hạn nhất định, hoạt chất trong phương thuốc ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ.
Tiến hành khảo sát sơ bộ cho thấy, phương thuốc được ngâm ở nhiệt độ phòng và cô thành cao đặc cho kết quả hàm lượng BBR và hiệu suất chiết BBR khá thấp, phương pháp chiết nóng với cùng điều kiện dung mơi thì cho kết quả cao hơn. Tuy nhiên, phương thuốc được chiết nóng với nước hoặc ethanol thấp độ cũng cho kết quả hàm lượng BBR và hiệu suất chiết BBR tương đối thấp. Khi thay đổi nồng độ ethanol sẽ ảnh hưởng đến khả năng hoà tan hoạt chất. Khi nồng độ ethanol 50% tăng dần thì hàm lượng và hiệu suất chiết BBR cũng tăng dần, tuy nhiên ở chính xác nồng độ ethanol 50% thì kết quả vẫn cịn thấp. Nồng độ ethanol 90% cho hiệu suất chiết cao nhất, với nồng độ ethanol 96% thì hiệu suất chiết BBR lại có xu hướng giảm. Nguyên nhân có thể là do mức độ phân cực của dung môi ethanol 90% tương đương với hợp chất BBR nhất, dẫn tới hoà tan chất tốt hơn so với ethanol 96%. Trong nghiên cứu này, phương pháp chiết nóng (ở nhiệt độ sơi của dung mơi) với ethanol 60-96% được lựa chọn để thiết kế thí nghiệm.
Chọn các điều kiện chiết xuất khác (tỉ lệ DM/DL, thời gian chiết và số lần chiết) để thiết kế thí nghiệm:
Tham khảo các tài liệu nghiên cứu bào chế cao có mơ tả giai đoạn chiết xuất từ một phương thuốc cho thấy thời gian chiết 1 lần thường từ 60-180 phút và số lần chiết thường dưới 3 lần. Thời gian chiết không chỉ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết mà còn chất lượng dịch chiết, thành phần và tỷ lệ thành phần các chất trong dịch chiết. Hoạt chất thường có kích thước phân tử nhỏ hơn tạp chất, khuếch tán và đạt cân bằng chiết nhanh hơn tạp chất, nên nếu kéo dài quá thời gian chiết sẽ làm tăng tỷ lệ tạp chất mà lại không tăng hoạt chất. Đối với số lần chiết, nếu tăng số lần chiết sẽ tăng số lần dược liệu được tiếp xúc với dung môi mới, tuy nhiên chiết quá nhiều lần dẫn tới dịch chiết lỗng, khó thu sản phẩm, tốn thời gian và năng lượng trong q trình thu hồi dung mơi để cơ cao đặc. Từ đó, chúng tơi đã chọn khoảng biến thiên của thời gian chiết là 60-180 phút/lần và khoảng biến thiên của số lần chiết là 1-3.
Tỷ lệ DM/DL là 4 ml/g là mức dung mơi thấp nhất đủ ngập hồn tồn dược liệu và có thể chiết kiệt hoạt chất trong quá trình chiết. Khi tăng tỷ lệ DM/DL có xu hướng tăng lượng hoạt chất hồ tan, có thể do lượng dung môi tăng làm chênh lệch nồng độ chất tan trong dược liệu với dịch chiết càng lớn, làm tăng sự khuếch tán hoạt chất từ dược liệu ra dịch chiết. Tuy nhiên khi tỷ lệ DM/DL > 12 ml/g thì lượng dịch chiết nhiều, lẫn nhiều tạp, thời gian chiết và cô cao dài gây tăng chi phí và khó khả thi khi áp dụng vào sản xuất quy mơ cơng nghiệp. Do đó, lựa chọn khoảng biến thiên của tỷ lệ DM/DL là 4 - 12ml/g.
34
Chọn mơ hình xử lí dữ liệu:
Mơ hình mạng neuron nhân tạo (Artificial neural network – ANN) có thể dự đốn mối quan hệ phi tuyến tính giữa các biến trong tệp dữ liệu, điều này khơng thể xảy ra với các mơ hình khác (hồi quy logistic…). Nó đã chứng minh được tính hiệu quả trong xử lý các bài tốn phức tạp có nhiều biến độc lập và biến phụ thuộc và được áp dụng rộng rãi trên những cơ sở dữ liệu lớn như thời tiết, chứng khốn,... Chính vì vậy, trong nghiên cứu này phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu hố dựa trên mạng neuron nhân tạo với sự hỗ trợ của phần mềm JMP Pro 15 đã được lựa chọn để xác định điều kiện chiết xuất tối ưu. Kết quả tối ưu hoá cho hàm lượng BBR khoảng 1,29% và hiệu suất chiết BBR khoảng 73,16%. Kiểm chứng mơ hình tại 1 điểm trong vùng tối ưu cho thấy kết quả thu được có độ chính xác cao so với dự đốn, chứng tỏ mơ hình đã xây dựng có độ tin cậy cao. Số thí nghiệm phải thực hiện theo phương pháp này không quá lớn vì vậy giảm cơng sức, chi phí và thời gian. Việc xác định vùng tối ưu (hay không gian thiết kế) thay cho xác định điểm (hay chỉ một điều kiện chiết xuất) tối ưu mang lại tính linh hoạt trong việc cải tiến và nâng cấp quy trình chiết xuất ở các bước nghiên cứu tiếp theo.
Tổng kết, quy trình chiết xuất để bào chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong được tối ưu về hàm lượng BBR và hiệu suất chiết BBR sử dụng thiết kế thí nghiệm D- optimal và phương pháp mạng neuron nhân tạo. Các thơng số của quy trình chiết xuất tối ưu được xác định gồm: Nồng độ ethanol là 90%, Tỷ lệ DM/DL là 8 ml/g, thời gian chiết là 90 phút, và số lần chiết là 3.
35
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1. Kết luận
Sau thời gian làm thực nghiệm, đề tài đã hoàn thành được mục tiêu đề ra với kết quả cụ thể như sau:
Đã điều chế được cao phương thuốc Tan thống phong theo quy trình chiết xuất bào chế cao đặc. Các mẫu cao thu được đều đạt các chỉ tiêu chung về thể chất (đặc quánh hoặc dẻo, sờ khơng dính tay ở nhiệt độ thường, nhưng chảy lỏng thành khối dịch đặc hoặc nhớt khi đun nóng), hình thức (màu nâu đen, hơi vàng) và độ ẩm (không quá 20%) theo quy định của DĐVN V.
Quy trình chiết xuất được tối ưu về hàm lượng BBR (≥ 1,2%) và hiệu suất chiết BBR (≥ 70%). Đã sử dụng phương pháp chiết nóng, lựa chọn dược liệu Hồng bá có kích thước < 2mm để chiết xuất. Kiểm chứng quy trình chiết xuất với thí nghiệm có các thông số được xác định như sau: Nồng độ ethanol 90%, tỷ lệ dung môi/dược liệu 8 ml/g, thời gian chiết 90 phút, số lần chiết 3. Tiến hành thí nghiệm theo điều kiện chiết xuất này cho kết quả hàm lượng BBR là 1,29% (độ chính xác 94,73% so với dự đốn), hiệu suất chiết BBR là 73,16% (độ chính xác 97,86% so với dự đốn).
Có thể thấy phương thuốc Tan thống phong có triển vọng trong bào chế cao đặc để phát triển sản phẩm.
5.2. Đề xuất
Đề tài xin đưa ra ý kiến đề xuất như sau:
- Tiếp tục nghiên cứu, hồn thiện quy trình chiết xuất điều chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong ở quy mô lớn hơn.
- Nghiên cứu định tính, định lượng các hoạt chất trong cao đặc Tan thống phong. - Nghiên cứu độ ổn định của cao đặc bài thuốc để xác định thời gian bảo quản, hạn
dùng.
- Nghiên cứu bào chế chế phẩm từ cao đặc và thử tác dụng sinh học của sản phẩm theo hướng điều trị gút như tác dụng hạ acid uric, giảm đau, chống viêm, chống phù.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Bộ Y tế (2020), Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị bệnh theo y học cổ truyền kết
hợp y học cổ truyền và y học hiện đại Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Tào Duy Cần, Hoàng Trọng Quang (2009), Phương Thang Y Học Cổ Truyền,
Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
4. Phan Thị Thanh Hoà (2010), Nghiên cứu phương thuốc Tam diệu thang gia giảm
theo hướng điều trị viêm khớp, Khoá luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học
Dược Hà Nội.
5. Nguyễn Trần Linh (2012), Một số phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu hoá
ứng dụng trong bào chế, Trường Đại học Dược Hà Nội.
6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
7. Phạm Xuân Sinh, Phùng Hồ Bình (2006), Dược học cổ truyền, Nhà xuất bản Y học Hà Nội.
8. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
9. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
10. Đỗ Hoàng Yến (2022), Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng và đánh giá tác dụng
hạ acid uric huyết trên thực nghiệm của cao đặc Tan thống phong, Luận văn
Thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
TIẾNG ANH
11. Chen Q., Wei W.(2003), "Effects and mechanisms of glucosides of chaenomeles speciosa on collagen-induced arthritis in rats", International Immunopharmacology, 3(4), pp. 593-608.
12. Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), " Pharmacopoeia of The People's Republic of China ", China Medical Science Press, 1, pp.
13. Bui Hong Cuong, Do Hoang Yen, et al. (2022), "Quantitative determinationoff berberine hydrochloride in the Tan Thong Phong viscous extracts by HPLC",
Journal of Medicinal Materials, 27, pp. 117-123.
14. Dong H., Zhao Y., et al. (2013), "The effects of berberine on blood lipids: a systemic review and meta-analysis of randomized controlled trials", Planta Med, 79(6), pp. 437-46.
15. Nguyen Thuy Duong, Thuong Phuong Thien, et al. (2017), "Anti-Hyperuricemic, Anti-Inflammatory and Analgesic Effects of Siegesbeckia orientalis L. Resulting from the Fraction with High Phenolic Content", BMC Complement Altern Med, 17(1), pp. 191.
16. He F., Wang W., et al. (2020), "Antioxidant and antibacterial activities of essential oil from Atractylodes lancea rhizomes", Industrial Crops and Products, 153, pp.
17. He X., Wang X., et al. (2017), "The genus Achyranthes: A review on traditional uses, phytochemistry, and pharmacological activities", J Ethnopharmacol, 203, pp. 260-278.
18. Ji, Huang Z. Y., et al. (2017), "Comprehensive profiling and characterization of chemical constituents of rhizome of Anemarrhena asphodeloides Bge", J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 1060, pp. 355-366.
19. Jiang Z., Yu Q. H., et al. (2011), "Simultaneous quantification of eight major constituents in Herba Siegesbeckiae by liquid chromatography coupled with electrospray ionization time-of-flight tandem mass spectrometry", J Pharm Biomed Anal, 55(3), pp. 452-7.
20. Kang Y.J., Chung H.-J., et al. (2011), "Cytotoxic and Antineoplastic Activity of Timosaponin A-III for Human Colon Cancer Cells", Journal of Natural Products, 74(4), pp. 701-706.
21. Lievense R. (2018), "Pharmaceutical Quality by Design Using JMP®: Solving Product Development and Manufacturing Problems", SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, pp.
22. Liu Y. F., Wen C. Y., et al. (2016), "Effects of Berberine on NLRP3 and IL-1beta Expressions in Monocytic THP-1 Cells with Monosodium Urate Crystals- Induced Inflammation", Biomed Res Int, 2016, pp. 2503703.
23. Miao J., Zhao C., et al. (2016), "Chemical Composition and Bioactivities of Two Common Chaenomeles Fruits in China: Chaenomeles speciosa and Chaenomeles sinensis", J Food Sci, 81(8), pp. H2049-58.
24. Naz H., Naz S., et al. (2021), "The Effect of Berberine, a Drug From Chinese Folk Medicine, on Serum and Urinary Uric Acid Levels in Rats With Hyperuricemia", Cureus, 13(2), pp. e13186.
25. Neag M. A., Mocan A., et al. (2018), "Berberine: Botanical Occurrence, Traditional Uses, Extraction Methods, and Relevance in Cardiovascular, Metabolic, Hepatic, and Renal Disorders", Front Pharmacol, 9, pp. 557.
26. Renbin Q., Ruizi S., et al. (2008), "Treatment of 60 Cases of Gouty Arthritis with Modified Simiao Tang", Journal of Traditional Chinese Medicine, 28(2), pp. 94- 97.
27. Renganathan V. (2019), "Overview of artificial neural network models in the biomedical domain", Bratisl Lek Listy, 120(7), pp. 536-540.
28. Sun Y., Lenon G. B., et al. (2019), "Phellodendri Cortex: A Phytochemical, Pharmacological, and Pharmacokinetic Review", Evid Based Complement Alternat Med, 2019, pp. 7621929.
29. Tillhon M., Guaman Ortiz L. M., et al. (2012), "Berberine: new perspectives for old remedies", Biochem Pharmacol, 84(10), pp. 1260-7.
30. Wang X., Wang C. P., et al. (2010), "The dual actions of Sanmiao wan as a hypouricemic agent: down-regulation of hepatic XOD and renal mURAT1 in hyperuricemic mice", J Ethnopharmacol, 128(1), pp. 107-15.
31. Wang Z., Cai J., et al. (2018), "Anti-Inflammatory Activities of Compounds Isolated from the Rhizome of Anemarrhena asphodeloides", Molecules, 23(10), pp.
32. Wang Z. J., Jin D. N., et al. (2021), "Bioactivity Ingredients of Chaenomeles speciosa against Microbes: Characterization by LC-MS and Activity Evaluation", J Agric Food Chem, 69(16), pp. 4686-4696.
33. Zha W., Liang G., et al. (2010), "Berberine inhibits HIV protease inhibitor- induced inflammatory response by modulating ER stress signaling pathways in murine macrophages", PLoS One, 5(2), pp. e9069.
34. Zhang L., Shi X., et al. (2020), "Network Pharmacology Approach to Uncover the Mechanism Governing the Effect of Radix Achyranthis Bidentatae on Osteoarthritis", BMC Complement Med Ther, 20(1), pp. 121.
35. Zhang R., Li S., et al. (2019), "Recent advances in valorization of Chaenomeles fruit: A review of botanical profile, phytochemistry, advanced extraction technologies and bioactivities", Trends in Food Science & Technology, 91, pp. 467-482.
36. Zhang W. J., Zhao Z. Y., et al. (2021), "Atractylodis Rhizoma: A review of its traditional uses, phytochemistry, pharmacology, toxicology and quality control",
J Ethnopharmacol, 266, pp. 113415.
37. Kimura Y., Sumiyoshi M. (2012), "Effects of an Atractylodes lancea rhizome extract and a volatile component β-eudesmol on gastrointestinal motility in mice", J Ethnopharmacol, 141(1), pp. 530-6.
38. Li Q., Huang Z., et al. (2021), "Effect of Berberine on Hyperuricemia and Kidney Injury: A Network Pharmacology Analysis and Experimental Validation in a