CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Xác định tính đặc hiệu và xây dựng đường chuẩn của phương pháp định lượng
lượng BBR trong cao đặc Tan thống phong 3.1.1. Kết quả tính đặc hiệu
- Mẫu nghiên cứu: mẫu trắng (dung môi), mẫu chuẩn BBR, mẫu thử cao đặc Tan thống phong.
- Tiến hành phân tích các mẫu như đã mô tả ở mục 2.3.2.2.
- Kết quả sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử lần lượt được biểu diễn trong Hình 3.1.
Hình 3.1. Sắc ký đồ các mẫu phân tích tính đặc hiệu ghi ở bước sóng 347nm Chú thích: 1. Mẫu dung mơi 2.Mẫu chuẩn BBR Chú thích: 1. Mẫu dung mơi 2.Mẫu chuẩn BBR
3.Mẫu thử cao đặc Tan thống phong
- Kết quả chồng phổ UV-VIS của pic BBR trong sắc ký đồ của mẫu thử so với pic BBR trong mẫu chuẩn được biểu diễn trong Hình 3.2.
21
Nhận xét: Trên sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện pic chính tách hồn tồn khỏi
các pic khác, pic cân đối và có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính BBR trên sắc ký đồ mẫu chuẩn. Mặt khác, tại thời gian đó trên SKĐ của mẫu trắng khơng xuất hiện pic. Bên cạnh đó, hệ số chồng phổ UV-VIS của pic BBR thu được trong sắc ký đồ của mẫu thử so với pic BBR trong mẫu chuẩn đạt 99,76%. Như vậy phương pháp HPLC định lượng BBR có tính đặc hiệu cao.
3.1.2. Kết quả xây dựng phương trình đường chuẩn BBR
- Mẫu nghiên cứu: Dãy chất chuẩn BBR có nồng độ tăng dần từ 34,44 µg/ml – 551,07 µg/ml.
- Tiến hành:
+ Từ dung dịch chuẩn gốc A: 6.27 mg BBR chuẩn (87.89%) trong 10ml Methanol, tiến hành pha lỗng gấp đơi được dãy các dung dịch chuẩn B, C, D, E và chạy sắc kí như điều kiện đã lựa chọn.
+ Xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ BBR trong các dung dịch chuẩn.
- Kết quả định lượng BBR trong các mẫu dung dịch chuẩn được trình bày ở Hình 3.3, Bảng 3.1. Đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ BBR trong các dung dịch chuẩn được biểu diễn ở Hình 3.4.
Hình 3.3. Sắc ký đồ dãy chuẩn ở bước sóng 347nm Chú thích: 1. Mẫu chuẩn E 4. Mẫu chuẩn B Chú thích: 1. Mẫu chuẩn E 4. Mẫu chuẩn B
2.Mẫu chuẩn D 5. Mẫu chuẩn A
22
Bảng 3.1. Nồng độ và kết quả các mẫu chuẩn A-E
STT Chuẩn Nồng độ (µg/ml) Diện tích peak (mAU.s)
1 E 34,44 802313 2 D 68,88 1541848 3 C 137,77 3054747 4 B 275,36 6147921 5 A 551,07 12134845 Hệ số góc a 21976 Hệ số chắn b 44379 Hệ số tương quan r 0,99998
Phương trình hồi quy y = 21976x + 44379
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ 33,44 - 551,07 µg/ml, có sự phụ thuộc tuyến
tính giữa nồng độ BBR và diện tích pic với hệ số tương quan r = 0,99998 (r2 =1) cho thấy đường chuẩn được xây dựng có độ tuyến tính cao, đảm bảo phép phân tích định lượng BBR.
3.2. Nghiên cứu điều chế cao đặc phương thuốc Tan thống phong và tối ưu hố
quy trình chiết xuất
3.2.1. Kết quả khảo sát các thông số điều chế cao
❖ Định lượng BBR trong dược liệu Hoàng bá
- Mẫu nghiên cứu: Dược liệu Hoàng bá đã được chế biến, xay thô thành bột. - Tiến hành:
+ Xác định độ ẩm bột dược liệu Hoàng bá theo phương pháp mất khối lượng do làm khô đã được mô tả ở mục 2.3.4.
+ Định lượng BBR trong dược liệu Hồng bá theo cách tiến hành đã được mơ tả ở mục 2.3.2.1.
- Kết quả định lượng BBR trong dược liệu Hồng bá được trình bày ở Bảng 3.2.
y = 21976x + 44379 R² = 1 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 0 100 200 300 400 500 600 Diện tích p ea k (mA U.s) Nồng độ BBR (µg/ml)
23
Bảng 3.2. Kết quả định lượng BBR trong dược liệu Hoàng bá.
Mẫu Khối lượng
DL (g) Độ ẩm DL (%) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ (µg/ml) Hàm lượng BBR (%) DL HB 1 0,1037 8,68 4253832 191,55 5,06 DL HB 2 0,1388 8,68 5697323 257,23 5,07 DL HB 3 0,2030 8,32 7812855 353,50 4,75 Trung bình 4,96
- Kết quả sắc ký đồ mẫu dược liệu Hồng bá đo ở bước sóng 347nm được biểu diễn ở Hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu dược liệu Hồng bá ở bước sóng 347nm
Nhận xét. Kết quả hàm lượng BBR trong Hoàng bá là 4,96%, đạt tiêu chuẩn quy
định của DĐTQ 2015 là khơng ít hơn 3,0%. Đây là nguyên liệu dùng để nghiên cứu tối ưu hố quy trình chiết xuất.
❖ Kết quả khảo sát phương pháp chiết:
- Mẫu nghiên cứu: Phương thuốc Tan thống phong. - Tiến hành thí nghiệm như mơ tả ở mục 2.3.5.
- Kết quả khảo sát dung mơi chiết được trình bày ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết BBR trong các mẫu cao đặc khảo sát
phương pháp chiết.
Mẫu Hàm lượng BBR (%) Hiệu suất chiết BBR (%)
Chiết nóng 1,14 63,59
Ngâm ở nhiệt độ phòng 0,71 37,57
Nhận xét: Phương pháp chiết nóng cho kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết BBR cao hơn nhiều so với phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, cụ thể hàm lượng BBR
24
cao gấp 1,61 lần, hiệu suất chiết BBR gấp 1,69 lần. Vì vậy, phương pháp chiết nóng được lựa chọn để chiết xuất phương thuốc Tan thống phong.
❖ Kết quả khảo sát kích thước của vị thuốc Hồng bá:
- Mẫu nghiên cứu: Phương thuốc Tan thống phong, trong đó dược liệu Hồng bá có các kích thước lần lượt là dạng phiến, > 2mm, < 2mm.
- Tiến hành thí nghiệm như mơ tả ở mục 2.3.5.
- Kết quả khảo sát kích thước được trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết BBR trong các mẫu cao đặc khảo sát
kích thước.
Mẫu Hàm lượng BBR (%) Hiệu suất chiết BBR (%)
Phiến 0,93 56,76
> 2mm 1,10 64,78
< 2mm 1,15 67,37
Nhận xét: Khi giảm kích thước dược liệu Hồng bá thì hàm lượng và hiệu suất
chiết BBR có xu hướng tăng nhẹ. Vì vậy kích thước dược liệu < 2mm được lựa chọn để làm nguyên liệu cho các mẫu nghiên cứu sau.
❖ Kết quả khảo sát dung môi chiết:
- Mẫu nghiên cứu: Phương thuốc Tan thống phong. - Tiến hành thí nghiệm như mơ tả ở mục 2.3.5.
- Kết quả khảo sát dung mơi chiết được trình bày ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết BBR trong các mẫu cao đặc khảo sát
dung môi.
Mẫu Hàm lượng BBR (%) Hiệu suất chiết BBR (%)
Nước 0,21 10,51 EtOH 30% 0,35 18,51 EtOH 50% 0,78 44,13 EtOH 70% 1,14 63,59 EtOH 90% 1,39 76,47 EtOH 96% 1,39 67,40
Nhận xét: Khảo sát chiết bằng nước và ethanol nồng độ 30%, 50%, 70%, 90%,
96% cho thấy: Với nước và ethanol 30% và 50% cho hàm lượng và hiệu suất chiết BBR thấp. Từ ethanol 50% đến ethanol 90% hàm lượng và hiệu suất chiết BBR tăng dần. Nồng độ ethanol 90% cho hiệu suất chiết cao nhất, với nồng độ ethanol 96% thì hiệu suất chiết BBR lại có xu hướng giảm nhẹ. Vì vậy, dung mơi ethanol 60 - 96% được lựa chọn để thiết kế thí nghiệm.
25
❖ Khoảng biến thiên của các biến đầu vào trong thiết kế thí nghiệm:
Tỷ lệ DM/DL là 4 ml/g là mức dung mơi thấp nhất đủ ngập hồn tồn dược liệu trong q trình chiết. Với tỷ lệ DM/DL > 12 ml/g thì lượng dịch chiết nhiều, thời gian chiết và cơ cao dài gây tăng chi phí và khó khả thi khi áp dụng vào sản xuất quy mô công nghiệp.
Tham khảo các tài liệu nhận thấy: thời gian cho mỗi lần chiết thông thường từ 60 đến 180 phút, số lần chiết thông thường 1-3 lần.
Từ đó, khoảng biến thiên của các biến đầu vào (biến độc lập) được xác định trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6. Khoảng biến thiên của các biến độc lập
Tên biến Ký hiệu
Khoảng biến thiên
Mức thấp Mức cao
Nồng độ ethanol (%) X1 60 96
Tỷ lệ DM/DL (ml/g) X2 4 12
Thời gian chiết (phút) X3 60 180
Số lần chiết X4 1 3
❖ Yêu cầu của các biến biến phụ thuộc: Hàm lượng BBR (Y1) → max ( ≥ 1,2%),
hiệu suất chiết BBR (Y2) → max ( ≥ 70%).
3.2.2. Thiết kế thí nghiệm
- Mẫu nghiên cứu: Phương thuốc Tan thống phong. - Tiến hành:
+ Thiết kế thí nghiệm bằng phần mềm JMP Pro 15 theo mơ hình D-optimal gồm 24 thí nghiệm như Bảng 3.7.
+ Điều chế cao đặc theo công thức (với các biến độc lập X1, X2, X3, X4), cân khối lượng cao thu được, xác định độ ẩm của cao đặc, định lượng BBR trong cao đặc và tính hiệu suất chiết BBR (theo quy trình lựa chọn).
- Kết quả: Các mẫu cao đều đạt các chỉ tiêu về độ ẩm, thể chất, màu sắc theo yêu cầu chung của cao đặc.
Kết quả hàm lượng và hiệu suất chiết BBR trong các mẫu thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.7.
Kết quả một số hình ảnh sắc ký đồ của các mẫu thí nghiệm được biểu diễn trong các Hình 3.6, Hình 3.7, Hình 3.8.
26
Bảng 3.7. Thiết kế thí nghiệm và kết quả biến phụ thuộc.
Thí nghiệm
Biến độc lập Biến phụ thuộc
X1 (%) X2 (ml/g) X3 (phút) X4 (lần) Y1 (%) Y2 (%) 1 60 4 120 2 0,91 44,09 2 78 4 180 3 1,19 64,20 3 78 8 120 1 1,34 56,15 4 78 8 120 2 1,19 70,84 5 60 12 60 1 1,11 59,03 6 96 4 180 1 1,35 44,85 7 96 12 60 1 2,21 79,15 8 60 4 60 1 0,88 27,98 9 60 12 60 3 1,14 76,05 10 60 12 180 3 1,09 75,25 11 96 4 120 3 1,38 67,69 12 60 12 180 1 1,04 49,03 13 96 12 180 3 1,92 97,84 14 96 8 180 2 1,22 63,15 15 96 12 180 1 1,75 79,82 16 82,68 12 60 3 1,35 85,13 17 79,98 4 60 2 1,24 52,95 18 96 8 60 3 1,56 84,82 19 60 4 60 3 0,94 53,15 20 78 8 120 1 1,21 48,26 21 96 4 60 1 1,97 47,00 22 60 4 180 1 0,77 33,32 23 60 7,24 180 3 0,98 64,75 24 96 12 120 3 1,45 85,02
27
Hình 3.6. Sắc ký đồ thí nghiệm 10 (Nồng độ EtOH 60%, tỷ lệ DM/DL= 12 ml/g, thời
gian chiết 180 phút, chiết 3 lần)
Hình 3.7. Sắc ký đồ thí nghiệm 15 (Nồng độ EtOH 96%, tỷ lệ DM/DL= 12 ml/g, thời
gian chiết 180 phút, chiết 1 lần).
3.2.3. Tối ưu hố quy trình chiết xuất
Xây dựng và đánh giá mơ hình: Sử dụng mạng neuron nhân tạo để thiết lập mối quan hệ
giữa các biến phụ thuộc và biến độc lập với thông số như sau: - Số neuron lớp vào: 4 (bằng số biến độc lập)
- Số neuron lớp ra: 2 (bằng số biến phụ thuộc) - Số neuron lớp ẩn: 6
- Hàm kích hoạt: hyperbol (tanH) - Tốc độ luyện: 0,1
28
Hình 3.8. Sơ đồ mạng neuron nhân tạo
Mơ hình mạng neuron nhân tạo được thẩm định bằng phương pháp thẩm định chéo (cross validation): Dữ liệu trong Bảng 3.7. được chia thành 5 nhóm, lần lượt lấy ra 1 nhóm để kiểm chứng mơ hình, 4 nhóm cịn lại dùng để xây dựng mơ hình. Kết quả đánh giá mạng neuron nhân tạo được trình bày ở Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả đánh giá mạng neuron nhân tạo.
Biến đầu ra
Thông số
Hàm lượng BBR Hiệu suất chiết BBR
Dữ liệu luyện Dữ liệu thẩm định Dữ liệu luyện Dữ liệu thẩm định R2 0,9418 0,9330 0,8974 0,9082 -LogLikelihood -18,5761 -8,0855 48,5676 24,8741 RMSE* 0,0758 0,0881 5,0356 5,4213 MAD** 0,0558 0,0779 3,8743 4,7687
* The root average square error: Căn bậc hai của sai số bình phương trung bình. ** The average of the absolute values of the differences: Giá trị sai khác tuyệt đối trung bình
Có thể nhận thấy, với cả hai tập dữ liệu luyện và thẩm định, giá trị R2 khá lớn (> 0,8) và giá trị -LogLikelihood, RMSE, MAD đều khá nhỏ nên mơ hình xây dựng được đáng tin cậy.
Sự biến thiên của các biến phụ thuộc theo các biến độc lập và giá trị của hàm hy vọng (Desirability function) dùng để tối ưu hoá điều kiện chiết xuất được biểu diễn trong Hình 3.10.
29
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên của các biến phụ thuộc theo các biến độc lập
và giá trị của hàm hy vọng
Nhận xét: Có thể nhận thấy rằng:
Khi nồng độ ethanol tăng, cả hàm lượng BBR và hiệu suất chiết BBR đều có xu hướng tăng lên, hàm lượng BBR tăng rõ và tuyến tính hơn hiệu suất chiết BBR.
Khi tỷ lệ DM/DL tăng, cả hàm lượng BBR và hiệu suất chiết BBR đều có xu hướng tăng lên tuyến tính.
Khi tăng dần thời gian chiết thì hàm lượng và hiệu suất chiết BBR có sự biến thiên nhưng khơng đáng kể. Cụ thể là ở trong khoảng thời gian chiết từ 80 phút đến 130 phút thì hàm lượng và hiệu suất chiết BBR có giảm nhẹ xuống.
Khi tăng số lần chiết từ 1 lên 2, hàm lượng BBR có xu hướng giảm, hiệu suất chiết BBR tăng nhẹ. Khi số lần chiết tăng lên 3, hàm lượng BBR tiếp tục giảm còn hiệu suất chiết tăng đáng kể.
3.2.4. Xác định các giá trị tối ưu của biến độc lập và kiểm chứng mơ hình
Điều kiện chiết xuất tối ưu được xác định bằng phương pháp hàm hy vọng tuyến tính (Desirability function). Đây là hàm số biểu diễn mức độ thoả mãn của người làm thí nghiệm theo giá trị của biến phụ thuộc (giá trị bằng 1 tương ứng với thoả mãn hoàn toàn). Giá trị của hàm hy vọng riêng d1 (tương ứng với biến Hàm lượng BBR (Y1)) và d2 (tương ứng với biến Hiệu suất chiết BBR (Y2) được trình bày ở Bảng 3.9.
30
Bảng 3.9. Giá trị của hàm hy vọng tuyến tính theo các biến phụ thuộc
Hàm lượng BBR (Y1) Hiệu suất chiết BBR (Y2)
Với giả thiết biến Hiệu suất chiết BBR có tầm quan trọng gấp đơi biến Hàm lượng BBR thì hàm hy vọng chung (d) được tính theo cơng thức:
Khơng gian thiết kế (Design space) tương ứng với giá trị Hàm lượng BBR (Y1) ≥ 1,2% và Hiệu suất chiết BBR (Y2) ≥ 70% được biểu diễn ở Hình 3.11.
Hình 3.10. Khơng gian thiết kế theo Nồng độ ethanol và Tỷ lệ DM/DL (vùng màu
trắng) (Thời gian chiết = 90; Số lần chiết = 3)
Sau khi phân tích và xác lập mơ hình liên quan giữa các biến đầu vào và đầu ra, tiến hành tối ưu các điều kiện chiết xuất bằng phương pháp hàm hy vọng tuyến tính với mục tiêu thu được hàm lượng BBR không dưới 1,2% và hiệu suất chiết BBR tối đa. Phần mềm JMP Pro 15 đã đưa ra giá trị tối ưu cho các điệu kiện chiết suất, đồng thời dự đoán kết quả thu được của biến đầu ra như sau:
- Nồng độ ethanol: 90% - Tỷ lệ DM/DL: 8 ml/g - Thời gian chiết: 90 phút - Số lần chiết: 3 lần 1 nếu Y1 ≥ 1,4 0 nếu Y1<1,2 𝑌1−1,2 1,4−1,2 nếu 1,2 ≤ Y1<1,4 d1 = 1 nếu Y2 ≥ 75 0 nếu Y2<70 𝑌2−70 75−70 nếu 70 ≤ Y2<75 d2 =
31
Với điều kiện này, hàm lượng BBR và hiệu suất chiết BBR trong cao đặc được dự đoán lần lượt là 1,36% và 74,76%.
Kết quả tính tốn điều kiện chiết xuất tối ưu (tương ứng với d → max) được trình bày ở Bảng 3.10 (đây là một điểm trong khơng gian thiết kế). Tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng BBR và hiệu suất chiết BBR theo điều kiện chiết xuất tối ưu này, lặp lại 3 lần. Kết quả so sánh giữa số liệu thực nghiệm với dự đốn của mơ hình cũng được trình bày ở Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Giá trị dự đoán và kết quả thực nghiệm kiểm chứng (n=3)
Mẫu
Biến độc lập Biến phụ thuộc
X1 (%) X2 (ml/g) X3 (ph) X4 (lần) Y1 (%) Y2 (%) Dự đoán Thực nghiệm Độ chính xác (%) Dự đốn Thực nghiệm Độ chính xác (%) 1 90 8 90 3 1,33 74,23 2 90 8 90 3 1,20 69,27 3 90 8 90 3 1.34 75.98 TB 1,36 1,29 ±0,07 94,73 74,76 73,16 ± 3,48 97,86
Sắc ký đồ định lượng BBR trong cao đặc Tan thống phong của các mẫu kiểm chứng được biểu diễn trong Hình 3.12.
Hình 3.11. Sắc ký đồ các mẫu kiểm chứng Chú thích: 1,2,3: Lần lượt là các mẫu kiểm chứng lần 1, lần 2, lần 3. Chú thích: 1,2,3: Lần lượt là các mẫu kiểm chứng lần 1, lần 2, lần 3.
Như vậy, từ kết quả ở Bảng 3.10, điều kiện chiết xuất với nồng độ ethanol là 90%, tỷ lệ DM/DL là 8 ml/g, thời gian chiết là 90 phút, số lần chiết là 3, thực nghiệm cho kết quả gần với dự đoán của phần mềm được chọn. Độ chính xác của hàm lượng BBR đạt 94,73%, độ chính xác của hiệu suất chiết BBR đạt 97,86%.
32