Theo cơ chế đề xuất trên, phản ứng ngưng tụ tổng hợp chất V xảy ra do cặp
electron trên nguyên tử nitơ của hợp chất IV sẽ tấn công vào liên kết C=O của
benzaldehyd và tạo thành hợp chất trung gian carbon tứ diện, tiếp theo đó hợp chất này loại bỏ một phân tử nước tạo ra sản phẩm là hợp chất V.
Acid acetic được sử dụng với vai trò cung cấp ion H+ làm xúc tác cho phản ứng. Đồng thời, phản ứng được xảy ra ở nhệt độ cao thúc đẩy sự loại nước tại thành ra khỏi hỗn hợp, giúp chuyển dịch phản ứng theo chiều thuận.
3.3.2. Khẳng định cấu trúc
Khóa luận đã khẳng định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp thông qua các loại phổ: phổ hồng ngoại (IR), khổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và
13C-NMR).
3.3.2.1. Phổ hồng ngoại
Có thể nhận dạng sơ bộ sự xuất hiện của một số nhóm chức, một số liên kết thơng qua các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ IR (xem phụ lục từ 1-6). Cụ thể:
- Ở khoảng 3206 - 3186 cm-1 cũng thể hiện khá rõ nét dao động hóa trị của liên kết O-H. Dao động này nằm ở dải thấp so với dao động thường thấy của liên kết O-H (3200- 3500 cm-1) tuy nhiên điều này có thể được giải thích do O-H tạo liên kết hydro với nhóm C=N kế bên
- Trong khoảng 1697-1694 cm-1 có sự xuất hiện của dao động hóa trị liên kết C=O - Từ 1668 - 1638 cm-1 có thể nhận biết dao động hóa trị của liên kết C=N
- Trong vùng từ 1607 - 1597 cũng có thể nhận ra dao động hóa trị của liên kết C=C - Ngồi ra, các dao động hóa trị của liên kết C-H có thể được nhận biết ở dải hấp thụ 3084 - 2862 cm-1
Như vậy, có thể thấy rằng dữ liệu phổ IR phù hợp với công thức cấu tạo dự kiến của 6 chất Va-f đã tổng hợp được. Tuy nhiên, phổ IR chưa thể cung cấp đầy đủ thông
45
số để khẳng định cấu trúc của các chất. Để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất, cần thêm dữ liệu của phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
3.3.2.2. Phổ khối lượng
Trên phổ đồ của của 6 chất Va-f (phụ lục 7-12) đều xuất hiện pic ion có giá trị bằng [M-H]- (hợp chất Va) hoặc bằng [M+H]+ (hợp chất Vb, Vc, Vd, Ve, Vf) với cường độ mạnh. Từ đó có thể sơ bộ khẳng định được các chất Va-f đã tổng hợp được có đúng số khối như dự kiến.
Ví dụ, trên phổ đồ MS của dẫn chất Vb có thể thấy giá trị của pic ion phân tử bằng khối lượng phân tử C20H17FN4O3 với cường độ mạnh nhất. Ngoài ra, các pic phân mảnh khác có cường độ yếu hơn.
3.3.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân a, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Trên phổ đồ của các chất (phụ lục 13 - 18 và bảng 3.5) ta nhận thấy:
- Các proton trong các vòng thơm nằm trong vùng dịch chuyển hóa học từ 8,5-6,90 ppm. - Proton trong nhóm -OH xuất hiện trên phổ đồ với độ dịch chuyển trong khoảng 12,30- 11,24 ppm.
- Tín hiệu của proton ở nhóm -NH của gốc acetohydrazid trong khoảng 11,70-10,10 pppm nằm cao hơn so với đỉnh của proton linh động trong nhóm -OH do độ âm điện của O lớn hơn kéo theo việc làm giảm mật độ điện tích nằm trên hydro.
Ví dụ trên phổ đồ của chất Vd (xem hình 3.3) có thể thấy xuất hiện đầy đủ các pic tương ứng với các proton như đã phân tích với cường độ mạnh và rõ nét.
46
b, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13Carbon
Hình 3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của dẫn chất Vd
47
Phổ 13C-NMR có ưu điểm là tồn bộ carbon trong phân tử các chất đều cho tín hiệu được tách rõ ràng dạng mũi tên đơn do được đo ở dạng phổ 13C khử hoàn toàn tương tác spin-spin, Trên phổ đồ các chất Va-f đã thể hiện tương ứng số lượng carbon có trong phân tử.
Trên phổ đồ 13C-NMR của dẫn chất Vd (xem hình 3.3) có thể thấy xuất hiện đầy đủ các pic tương ứng với số lượng C trong công thức C20H17BrN4O3 với cường độ mạnh và sắc nét.
Như vậy, kết hợp kết quả phân tích các phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định 6 dẫn chất Va-f đã tổng hợp được có cơng thức cấu tạo hồn tồn đúng như dự kiến.
3.3.3. Thử hoạt tính sinh học
Tác dụng sinh học của 6 dẫn chất Va-f được thể hiện thông qua tác dụng gây độc lên tế bào ung thư in vitro và đại diện dẫn chất Vb được tiến hành thử tác dụng hoạt hóa caspase 3.
3.3.3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Hình 3.5. Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất Va-f trên các dòng tế bào SW620, PC-3 và NCI-H23
Kết quả thu được trong bảng 3.7 cho thấy sự so sánh rõ ràng các dẫn chất tổng hợp được có độc tính tế bào tốt hơn hẳn chất đối chứng dương là 5-FU và PAC-1 từ 2-6 lần trên cả ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
Cụ thể, khi xem từng dẫn chất, chúng tơi thấy rằng:
Dẫn chất Va có vịng quinazolin khơng nhóm thế chỉ thể hiện khả năng gây độc tế bào ở mức độ trung bình (IC50 = 2,71 đến 3,9 µM). So với chất đối chứng là 5-FU,
0 2 4 6 8 10 12 14 16 SW620 PC-3 NCI-H23 Độc tính tế bào IC 50 (µM) Va Vb Vc Vd Ve Vf 5-FU PAC-1
48
tác dụng gây độc của Va trên cả 3 dòng tế bào mạnh hơn gấp từ 2 - 3 lần. Còn khi so sánh kết quả thử độc tính tế bào với chất đối chứng là PAC-1 thì chất Va vẫn cho kết quả gần tương đương.
Các dẫn chất Vb, Vc, Vd, Ve, Vf với các nhóm thể ở hợp phần quinazolin làm tăng rõ rệt độc tính trên tế bào ở cả 3 dòng tế bào ung thư (IC50 = 0,32 đến 1,38 µM) so với hợp chất Va khơng có nhóm thể. Kết quả của việc gắn thêm nhóm thế khóa luận thu được hợp chất mới làm tăng độc tính tế bào từ 2,3 đến 7,7 lần so với nhóm chứng là PAC-1.
Các nhóm thế được khóa luận thiết kế đều là nhóm hút e nên có thể nhận thấy là việc gắn thêm nhóm thế hút e sẽ làm tăng độc tính tế bào ở dẫn chất tổng hợp được.
Các dẫn chất Vb, Vc với nhóm thế đều là -F, cũng như các dẫn chất Vd, Ve với nhóm thế đều là -Br ở vị trí lần lượt là 6-F, 7-F, 6-Br, 7-Br thu được kết quả có sự thay đổi khi đổi vị trí nhóm thế. Cụ thể, việc gắn -F hoặc -Br vào vị trí thứ 6 ở các dẫn chất
Vb (IC50 = 0,39 đến 0,70 µM) và Vd (IC50 = 0,32 đến 0,41 µM) làm cho tác dụng gây
độc tế bào cao hơn so với gắn vào vị trí thứ 7 ở các dẫn chất Vc (IC50 = 0,76 đến 1,38 µM) và Ve (IC50 = 0,43 đến 0,7 µM).
Ở vị trí thể số 6 trên hợp phần quinazolin, khóa luận có 3 dẫn chất Vb, Vd, Vf với các nhóm thế lần lượt là 6-F, 6-Br, 6-I cho kết quả gây độc tính rất tốt ở cả 3 dịng tế bào nhưng với các mức độ khác nhau theo thứ tự Vb > Vd >Vf. Khi đó ta có giả thiết, ở cùng 1 vị trí thể với các nhóm thế càng hút e (F > Br > I) thì gây ra độc tính tế bào càng tăng lên.
Dẫn chất Vb với nhóm thế 6-F có đầy đủ tiêu chí theo giả thiết: khung cấu trúc quinazolin, nhóm thế hút e, thế ở vị trí số 6 đã thể hiện tác dụng ức chế cả ba dòng tế bào ung thư thử nghiệm mạnh nhất trong số 6 chất tổng hợp được đáp ứng đủ có khung cấu trúc.
Từ biểu đồ trên, các hợp chất mới được khóa luận tổng hợp mang khung cấu trúc 4-oxoquinazolin có kết quả độc tính tế bào ở mức tốt. Đặc biệt khi thay thế các nhóm thế có tính hút điện tử càng mạnh thì độc tính với tế bào càng lớn. So sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả Lê Công Huân [18], điều này một lần nữa được khẳng định về việc gắn thêm nhóm thế hút e sẽ làm tăng độc tính lên tế bào ung thư được thử nghiệm.
Nhìn tổng thể, các dẫn chất gắn nhóm hút e (Vb, Vd, Ve, Vf) cho thấy sự khác biệt rõ về hoạt tính sinh học. Ngồi ra 6 dẫn chất vẫn cho kết quả gây độc tính tế bào trên 3 dịng ung thư. Từ đó cho thấy hướng nghiên cứu các dẫn chất acetohydrazid mang khung 4-oxoquinazolin là một hướng nghiên cứu đúng đắn và đầy tiềm năng trong việc tìm ra các dẫn chất mới trong điều trị ung thư.
49
3.3.3.2. Kết quả thử tác dụng hoạt hóa caspase 3
Dẫn chất Vb thể hiện khả năng gây độc tính tốt trên ba dịng tế bào (tế bào
SW620, tế bào PC-3, tế bào NCI-H23) trong các dẫn chất mới được tổng hợp. Do vậy, dẫn chất Vb được khóa luận thử tác dụng hoạt hóa caspase 3 với chất đối chứng PAC-1 Kết quả đánh giá hoạt tính hoạt hóa caspase 3 (biểu đồ 3.1) cho thấy hợp chất Vb chưa có khả năng hoạt hóa caspase 3 rõ ràng khi so với chất chứng là PAC-1.
Để bàn luận về kết quả thử hoạt hóa caspase 3 của Vb, từ chất dẫn đường là
PAC-1 có cấu trúc gồm 3 phần và nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng vùng B trong cấu trúc đóng vai trị quan trọng trong cơ chế khóa ion kẽm. Do vậy nhóm nghiên cứu thiết kế cấu trúc các dẫn chất mới theo hướng giữ lại vùng B trong cấu tạo. Kết quả đánh giá khả năng hoạt hóa caspase-3 của Vb chưa rõ ràng chứng tỏ rằng 2 hợp phần còn lại trong cấu trúc của PAC-1 cũng có thể có vai trị quan trọng trong định hướng thiết kế các chất có tác dụng hoạt hóa caspase-3.
50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau:
1.1. Về tổng hợp và khẳng định cấu trúc
- Đã tổng hợp được 6 dẫn chất như dự kiến Va-f và cả 6 dẫn chất này đều chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu tham khảo nào.
✓ (E)-N'-(3-allyl-2-hydroxybenzyliden)-2-(4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)acetohydrazid ✓ (E)-N'-(3-allyl-2-hydroxybenzyliden)-2-(6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)acetohydrazid ✓ (E)-N'-(3-allyl-2-hydroxybenzyliden)-2-(7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)acetohydrazid ✓ (E)-N'-(3-allyl-2-hydroxybenzyliden)-2-(6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)acetohydrazid ✓ (E)-N'-(3-allyl-2-hydroxybenzyliden)-2-(7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)acetohydrazid ✓ (E)-N'-(3-allyl-2-hydroxybenzyliden)-2-(6-iodo-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)acetohydrazid
- Đã khẳng định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được nhờ phân tích các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR.
1.2. Về hoạt tính sinh học
Đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được và thử tác dụng hoạt hóa caspase 3 của hợp chất Vb. Kết quả cho thấy:
- Tác dụng kháng tế bào ung thư: cả 6 dẫn chất đều có hoạt tính ức chế tốt trên 3 dịng tế bào ung thư (ung thư đại tràng SW620, ung thư tuyến tiền liệt PC-3, ung thư phổi thể không nhỏ NCI-H23) khi so với chất chứng là 5-FU, PAC-1.
- Dẫn chất Vb chưa thể hiện khả năng hoạt hoát caspase 3 rõ ràng.
2. Kiến nghị
- Tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro của các dẫn chất tổng hợp được trên những dòng tế bào ung thư khác như tế bào ung thư tuyến tuỵ AsPC-1, tế bào ung thư vú… nhằm sàng lọc được các dẫn chất có tác dụng mạnh, làm cơ sở cho việc thử tác dụng in vivo.
- Thử nghiệm khả năng hoạt hóa các caspase khác của những dẫn chất mới tổng hợp được.
- Thử nghiệm thiết kế, tổng hợp dẫn xuất quinazolin khác để sàng lọc thêm các hợp chất tiềm năng đặc biệt là chứa các nhóm thế ở vị trí số 6.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Dương Tiến Anh, Đào Thị Kim Oanh, et al. "tổng hợp và thử tác dụng ức chế tế bào ung thư của một số dẫn chất acetohydrazid mới mang khung quinazolin",
NghiêncứuDược&Thôngtinthuốc2020,Tập11, Số1+2, pp. 2-5.
TIẾNG ANH
2. Aiuchi Toshihiro, Mihara Saori, et al. (1998), "Zinc ions prevent processing of caspase-3 during apoptosis induced by geranylgeraniol in HL-60 cells", The Journal of Biochemistry, 124(2), pp. 300-303.
3. Bommagani Shobanbabu, Lee Na-Ra, et al. (2015), "Synthesis of O-and N- alkylated products of 1, 2, 3, 4-tetrahydrobenzo [c][2, 7] naphthyrin-5 (6H)-one",
Tetrahedron letters, 56(46), pp. 6472-6474.
4. Brown J Martin, Attardi Laura D (2005), "The role of apoptosis in cancer development and treatment response", Nature reviews cancer, 5(3), pp. 231-237. 5. Devarajan Eswaran, Sahin Aysegul A, et al. (2002), "Down-regulation of caspase 3 in breast cancer: a possible mechanism for chemoresistance", Oncogene,
21(57), pp. 8843-8851.
6. Duong T Anh Pham-The Hai, Le D Huy Hoang B Ngoc, et al. (2021), "Novel 4- oxoquinazoline-based N-hydroxypropenamides as histone deacetylase inhibitors: Design, synthesis, and biological evaluation", ACS omega, 6(7), pp.
4907-4920.
7. El-Sayed Nahed NE, Almaneai Norah M, et al. (2019), "Synthesis and evaluation of anticancer, antiphospholipases, antiproteases, and antimetabolic syndrome activities of some 3 H-quinazolin-4-one derivatives", Journal of enzyme inhibition and medicinal chemistry, 34(1), pp. 672-683.
8. Elmore Susan (2007), "Apoptosis: a review of programmed cell death",
Toxicologic pathology, 35(4), pp. 495-516.
9. Eron Scott J, MacPherson Derek J, et al. (2018), "Multiple mechanisms of zinc- mediated inhibition for the apoptotic caspases-3,-6,-7, and-8", ACS chemical biology, 13(5), pp. 1279-1290.
10. Farrugia David C, Ford Hugo ER, et al. (2003), "Thymidylate synthase expression in advanced colorectal cancer predicts for response to raltitrexed",
Clinical cancer research, 9(2), pp. 792-801.
11. Finney David John (1952), Probit analysis: a statistical treatment of the sigmoid
12. Ghavami Saeid, Hashemi Mohammad, et al. (2009), "Apoptosis and cancer: mutations within caspase genes", Journal of medical genetics, 46(8), pp. 497-
510.
13. He Lin, Li Haoquan, et al. (2014), "Recent advances in 4 (3 H)-quinazolinone syntheses", RSC advances, 4(24), pp. 12065-12077.
14. Houghton Peter, Fang Rui, et al. (2007), "The sulphorhodamine (SRB) assay and other approaches to testing plant extracts and derived compounds for activities related to reputed anticancer activity", Methods, 42(4), pp. 377-387.
15. Kassab Asmaa E, Hassan Rasha A (2018), "Novel benzotriazole N- acylarylhydrazone hybrids: design, synthesis, anticancer activity, effects on cell cycle profile, caspase-3 mediated apoptosis and FAK inhibition", Bioorganic chemistry, 80, pp. 531-544.
16. Kerr John FR, Wyllie Andrew H, et al. (1972), "Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics", British journal of
cancer, 26(4), pp. 239-257.
17. Krepela Evzen, Procházka Jan, et al. (2004), "Increased expression of Apaf-1 and procaspase-3 and the functionality of intrinsic apoptosis apparatus in non-small cell lung carcinoma", Biological chemistry, 385(2), pp. 153-168.
18. Le Cong Huan Duong Tien Anh, Bui Xuan Truong, Phan Huy Duc, Pham‐The Hai, , Lai Duc‐Anh Le‐Thi‐Thu Huong, et al. (2020), "New Acetohydrazides Incorporating 2‐Oxoindoline and 4‐Oxoquinazoline: Synthesis and Evaluation of Cytotoxicity and Caspase Activation Activity", Chemistry & Biodiversity, 17(3), pp. e1900670.
19. Ma Junjie, Chen Dong, et al. (2014), "Design, synthesis, and structure–activity relationships of novel benzothiazole derivatives bearing the ortho-hydroxy N- carbamoylhydrazone moiety as potent antitumor agents", European journal of medicinal chemistry, 86, pp. 257-269.
20. Ma Junjie, Hu Gang, et al. (2015), "Design, synthesis and biological evaluation of novel benzothiazole derivatives bearing semicarbazone moiety as antitumor agents", Chemical Research in Chinese Universities, 31(6), pp. 958-963.
21. Mhaske Santosh B, Argade Narshinha P (2006), "The chemistry of recently isolated naturally occurring quinazolinone alkaloids", Tetrahedron, 62(42), pp.
9787-9826.
22. Mulakayala Naveen, Kandagatla Bhaskar, et al. (2012), "InCl3-catalysed synthesis of 2-aryl quinazolin-4 (3H)-ones and 5-aryl pyrazolo [4, 3-d] pyrimidin-7 (6H)-ones and their evaluation as potential anticancer agents",
23. O’Donovan Norma, Crown John, et al. (2003), "Caspase 3 in breast cancer",
Clinical Cancer Research, 9(2), pp. 738-742.
24. Peterson Quinn P, Goode David R, et al. (2009), "PAC-1 activates procaspase-3 in vitro through relief of zinc-mediated inhibition", Journal of molecular biology, 388(1), pp. 144-158.
25. Pfeffer Claire M, Singh Amareshwar TK (2018), "Apoptosis: a target for anticancer therapy", International journal of molecular sciences, 19(2), pp. 448.