CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học
Tổng hợp các chất dựa trên các nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành tổng hợp các chất theo thiết kế. Cụ thể các phản ứng sử dụng:
- Phản ứng N-alkyl hóa với tác nhân là ethylcloro acetat - Phản ứng acyl hóa với tác nhân hydrazin monohydrat - Phản ứng ngưng tụ loại nước
- Một số phản ứng cơ bản khác
Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc kí lớp mỏng (TLC).
2.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC (xác định thời điểm kết thúc phản ứng, độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế) và xác định nhiệu độ nóng chảy.
17
2.3.3. Xác định cấu trúc của dẫn chất tổng hợp được
- Xác định cấu trúc của những chất được tổng hợp bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR).
- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại bộ mơn Hóa vơ cơ, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1. Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm. Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1.
- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại khoa Hóa học - trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, dung môi MeOH.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại đặt tại khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz. Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d6.
2.3.4. Thử tác dụng sinh học 2.3.4.1. Thử độc tế bào 2.3.4.1. Thử độc tế bào
- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được tiến hành tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB [14] và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probit [11].
Dòng tế bào thử nghiệm: tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3), tế bào ung thư đại
tràng (SW-620) và tế bào ung thư phổi (NCI-H23). Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò).
Nguyên tắc thử: Xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang
học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamon B (SRB). Giá trị OD đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn.
Tính kết quả: Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi
18
được tính theo phương pháp Probits và kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần đo với độ lệch chuẩn không quá 10%.
2.3.4.2. Thử hoạt hóa caspase 3
Tác dụng hoạt hóa caspase 3 được thử nghiệm tại khoa Dược, Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc và được định lượng bằng bộ kit của Abcam.
Cách tiến hành: tế bào ung thư bạch huyết ở người (U937) được cấy vào 6 giếng
(nồng độ 5 x 105/ml mỗi giếng) và phát triển trong 24 giờ, sau đó thu lại. Các tế bào thu được sẽ được rửa 2 lần với PBS lạnh và xử lí với đệm li giải đi cùng bộ kit trên. Chất li giải tế bào (100 µ/50 µL) được trộn cùng với 2 µL đệm phản ứng và 5 µL DEVD-p-NA theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất. Hoạt tính được định lượng bằng phương pháp huỳnh quang sau 1 giờ ủ.
19