Thẩm định phương pháp

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.4. Thẩm định phương pháp

2.3.4.1. Độ thích hợp hệ thống

Thực nghiệm

- Dung dịch chuẩn gốc Rupatadin (GRP):

Cân chính xác khoảng 64,0 mg rupatadin fumarat chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung môi pha mẫu ở trên rồi tiến hành lắc siêu âm trong 10 phút. Sau đó để dung dịch trở về nhiệt độ phịng rồi thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ.

Cân chính xác khoảng 45,0 mg methyl paraben cho vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung môi pha mẫu ở trên rồi tiến hành lắc siêu trong 10 phút. Sau đó để dung dịch trở về nhiệt độ phịng rồi thêm dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ.

- Dung dịch chuẩn gốc propyl paraben (GPP):

Cân chính xác khoảng 25,0 mg methyl paraben cho vào bình định mức 100 ml, thêm 60 ml dung môi pha mẫu ở trên rồi tiến hành lắc siêu trong 10 phút. Sau đó để dung dịch trở về nhiệt độ phịng rồi thêm dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ.

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp:

Chuẩn bị 2 dung dịch chuẩn hỗn hợp 1 và chuẩn hỗn hợp 2

Hút chính xác khoảng 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc rupatadin, 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc methyl paraben và 1,0 ml propyl paraben cho vào bình định mức 50 ml. Thêm dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc kỹ. Thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp rupatadin, methyl paraben và propyl paraben.

- Cách tiến hành:

Tiêm 06 lần mẫu chuẩn hỗn hợp 1 và 03 lần mẫu chuẩn hỗn hợp 2 vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi kết quả thu được: sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích chính tạo bởi rupatadin, methyl paraben và propyl paraben. Tính giá trị trung bình và RSD của thời gian lưu và diện tích pic.

2.3.4.2. Độ đặc hiệu

Thực nghiệm

Để thẩm định độ đặc hiệu của phương pháp, sử dụng mẫu thử, mẫu placebo (1), (2),

(3) và (4) do công ty dược cung cấp:

Bảng 2. 1: Thành phần hàm lượng mẫu thử, mẫu placebo (1), mẫu placebo (2), mẫu placebo (3), mẫu placebo (4) trong 100ml siro

STT Thành phần Hàm lượng mẫu thử Hàm lượng mẫu placebo (1) Hàm lượng mẫu placebo (2) Hàm lượng mẫu placebo (3) Hàm lượng mẫu placebo (4) 1 Rupatadin (dưới dạng muối rupatadin fumarat) 100 mg (128 mg) Khơng có Khơng có 100 mg (128 mg) 100 mg (128 mg) 2 Methyl paraben 90 mg Khơng có 90 mg Khơng có 90 mg

3 Propyl paraben 10 mg Khơng có 10 mg 10 mg Khơng có

4 Đường trắng 25 g 25 g 25 g 25 g 25 g 5 Natri sacharin 20 mg 20 mg 20 mg 20 mg 20 mg 6 Propylen glycol 10 g 10 g 10 g 10 g 10 g 7 Glycerin 5 g 5 g 5 g 5 g 5 g 8 Acid citric 500 mg 500 mg 500 mg 500 mg 500 mg 9 Dinatri phoshat 700 mg 700 mg 700 mg 700 mg 700 mg 10 Hương cam AAP - 11740 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 0,05 ml 11 Màu vàng tươi Quinoline Yellow 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg

12 Nước tinh khiết Vđ 100 ml Vđ 100 ml Vđ 100 ml Vđ 100 ml Vđ 100 ml

- Dung dịch placebo (1-4):

Khối lượng riêng của chế phẩm: D = 1,127 g/ml

Cân một lượng mẫu placebo (1-4) tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) vào bình định mức 50 ml, thêm 30 ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (01 lần tiêm).

- Dung dịch chuẩn:

Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp rupatadin, methyl paraben và propyl paraben theo như phần 2.3.4.1. Độ thích hợp hệ thống (tiêm 01 lần).

- Dung dịch thử:

Khối lượng riêng của chế phẩm: D = 1,127 g/ml

Cân chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) cho vào bình định mức 50 ml. Thêm 30 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm trong 10 phút. Sau đó để dung dịch trở về nhiệt độ phịng rồi thêm dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (01 lần tiêm).

Tiến hành chạy sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch thử và các dung dịch placebo (1), (2), (3) và (4) theo quy trình phân tích.

2.3.4.3. Khoảng tuyến tính

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của rupatadin, methyl paraben và propyl paraben trên các dung dịch chuẩn.

Sử dụng dung dịch chuẩn gốc rupatadin, methyl paraben và propyl paraben trong phần 2.3.4.1. Độ thích hợp hệ thống để pha các dung chuẩn tiến hành khảo sát.

Tiến hành pha loãng các dung dịch chuẩn gốc rupatadin, methyl paraben và propyl paraben với dung môi pha mẫu để thu được 05 dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 50%, 80%, 100%, 120%, 150% so với dung dịch chuẩn gốc.

Bảng 2. 2 : Chuẩn bị dung dịch đo khoảng tuyến tính

Khoảng nồng

độ

Rupatadin Methyl paraben Propyl paraben

Hút chính xác V ml → 50ml Nồng độ (mg/ml) Hút chính xác V ml → 50ml Nồng độ (mg/ml) Hút chính xác V ml → 50ml Nồng độ (mg/ml) 50% 2,5 ml 0,025 2,5 ml 0,0225 0,5 ml 0,0025 80% 4,0 ml 0,040 4,0 ml 0,036 0,8 ml 0,004 100% 5,0 ml 0,050 5,0 ml 0,045 1,0 ml 0,005 120% 6,0 ml 0,060 6,0 ml 0,054 1,2 ml 0,006 150% 7,5 ml 0,075 7,5 ml 0,0675 1,5 ml 0,0075

Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,4 5μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn (mỗi dung dịch tiêm 01 lần).

Ghi các giá trị diện tích pic đo được ứng với nồng độ các dung dịch trên. 2.3.4.4. Độ đúng

Thực nghiệm

- Dung dịch GRP:

Hịa tan chính xác khoảng 64,0 mg rupatadin fumarat chuẩn vào 100,0 ml dung môi (~ 0,5 mg/ml). Pha 03 dung dịch khác nhau.

- Dung dịch GMP:

Hịa tan chính xác khoảng 45,0 mg methyl paraben chuẩn trong 100,0 ml dung môi (~ 0,45 mg/ml). Pha 03 dung dịch khác nhau.

- Dung dịch GPP:

Hịa tan chính xác khoảng 25,0 mg methyl paraben chuẩn trong 100,0 ml dung môi (~ 0,25 mg/ml). Pha 03 dung dịch khác nhau.

- Dung dịch chuẩn:

Sử dụng các dung dịch chuẩn ở phần 2.3.4.1. Độ thích hợp hệ thống. Pha các dung dịch thử sau:

Rupatadin

- Dung dịch thử (Ru-70):

Cân 2,8175 g mẫu placebo (2) vào bình định mức 50 ml, thêm 3,5 ml dung dịch GRP và 30 ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (70%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (Ru-70) tương ứng với 3 dung dịch GRP.

- Dung dịch thử (Ru-100):

Cân 2,8175 g mẫu placebo (2) vào bình định mức 50 ml, thêm 5,0 ml dung dịch GRP và 30 ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (100%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (Ru-100) tương ứng với 3 dung dịch GRP.

- Dung dịch thử (Ru-130):

Cân 2,8175 g mẫu placebo (2) vào bình định mức 50 ml, thêm 6,5 ml dung dịch GRP và 30 ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (130%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (Ru-130) tương ứng với 3 dung dịch GRP.

Methyl paraben

Khối lượng riêng của chế phẩm: D = 1,127 g/ml

- Dung dịch thử (MP-70):

Cân một lượng mẫu placebo (3) tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) vào bình định mức 50 ml, thêm 3,5 ml dung dịch GMP và 30ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (70%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (MP-70) tương ứng với 3 dung dịch GMP.

- Dung dịch thử (MP-100):

Cân một lượng mẫu placebo (3) tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) vào bình định mức 50 ml, thêm 5,0 ml dung dịch GMP và 30ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (100%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (MP-100) tương ứng với 3 dung dịch GMP.

- Dung dịch thử (MP-130):

Cân một lượng mẫu placebo (3) tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) vào bình định mức 50 ml, thêm 6,5 ml dung dịch GMP và 30ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng

0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (130%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (MP-130) tương ứng với 3 dung dịch GMP.

Propyl paraben

- Dung dịch thử (PP-70):

Cân một lượng mẫu placebo (4) tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) vào bình định mức 50 ml, thêm 0,7 ml dung dịch GPP và 30 ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (70%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (MP-70) tương ứng với 3 dung dịch GPP.

- Dung dịch thử (PP-100):

Cân một lượng mẫu placebo (4) tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) vào bình định mức 50 ml, thêm 1,0 ml dung dịch GPP và 30 ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (100%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (MP-100) tương ứng với 3 dung dịch GPP.

- Dung dịch thử (PP-130):

Cân một lượng mẫu placebo (4) tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) vào bình định mức 50ml, thêm 1,3ml dung dịch GMP và 30ml dung môi, lắc mạnh trong 10 phút, thêm dung môi vừa đủ đến vạch, lắc đều. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc (130%). Chuẩn bị 3 dung dịch thử (MP-130) tương ứng với 3 dung dịch GPP.

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và các dung dịch thử. Ghi lại diện tích pic rupatadin, methyl paraben và propyl paraben trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và các dung dịch thử, xác định tỷ lệ tìm lại (%) và RSD.

2.3.4.5. Độ lặp lại

Thực nghiệm

- Dung dịch chuẩn:

Sử dụng dung dịch chuẩn hỗn hợp rupatadin, methyl paraben và propyl paraben theo như phần 2.3.4.1. Độ thích hợp hệ thống.

- Dung dịch thử:

Khối lượng riêng của chế phẩm: D = 1,127 g/ml.

Cân chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) cho vào bình định mức 50 ml. Thêm 30 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm trong 10 phút. Sau

đó để dung dịch trở về nhiệt độ phịng rồi thêm dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc.

Pha 06 dung dịch thử khác nhau (mỗi dung dịch tiêm 01 lần).

2.3.4.6. Độ chính xác trung gian

Thực nghiệm

Kiểm nghiệm viên : Lấy kết quả ở mục 2.3.4.5. Độ lặp lại.

Tiến hành thực nghiệm độ lặp lại như kiểm nghiệm viên, nhưng ở một ngày khác.

- Dung dịch chuẩn gốc rupatadin :

Cân chính xác khoảng 64,0 mg rupatadin fumarat chuẩn cho vào bình định mức 100ml, thêm 60ml dung môi pha mẫu ở trên rồi tiến hành lắc siêu âm trong 10 phút. Sau đó để dung dịch trở về nhiệt độ phịng rồi thêm dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ.

- Dung dịch chuẩn gốc methyl paraben:

Cân chính xác khoảng 45,0 mg methyl paraben cho vào bình định mức 100ml, thêm 60 ml dung mơi pha mẫu ở trên rồi tiến hành lắc siêu trong 10 phút. Sau đó để dung dịch trở về nhiệt độ phịng rồi thêm dung mơi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ.

- Dung dịch chuẩn gốc propyl paraben:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp:

Hút chính xác khoảng 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc rupatadin, 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc methyl paraben và 1,0 ml propyl paraben cho vào bình định mức 50 ml. Thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc kỹ. Thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp rupatadin, methyl paraben và propyl paraben.

- Dung dịch thử:

Khối lượng riêng của chế phẩm: D = 1,127 g/ml

Cân chính xác một lượng chế phẩm tương ứng với 2,5 mg rupatadin (2,5 ml) cho vào bình định mức 50 ml. Thêm 30 ml dung môi pha mẫu, lắc siêu âm trong 10 phút. Sau đó để dung dịch trở về nhiệt độ phòng rồi thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc kĩ. Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 μm, loại bỏ vài ml dịch lọc đầu. Sử dụng dịch lọc.

Pha 12 dung dịch thử khác nhau (06 dung dịch cho mỗi kiểm nghiệm viên)

Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn hỗn hợp và các dung dịch thử. Ghi lại diện tích pic rupatadin, methyl paraben và propyl paraben trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và các dung dịch thử, xác định hàm lượng rupatadin, methyl paraben và propyl paraben (% so với nhãn) và RSD (n=12).

2.3.4.7. Phương pháp xử lý kết quả

Các kết quả sắc ký được xử lý bằng các phần mềm Empower 3 của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính tốn của Microsofl Office Excel.

Một số cơng thức tính tốn sử dụng trong xử lý thống kê kết quả: - Giá trị trung bình: X = ∑𝑛𝑖=1X𝑖

- Độ lệch chuẩn: SD = √∑ni=1(Xi − X )2 (n − 1 )

- Độ lệch chuẩntương đối: RSD(%) = SD

Chuẩn bị dung dịch đối chiếu