CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. KHẢO SÁT VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ
3.2.1. Lựa chọn cột sắc ký
Sắc kí phân bố pha đảo được lựa chọn để phân tích hoạt chất rupatadin là chất kém phân cực đồng thời với methyl paraben và propyl paraben.
Sử dụng cột hiện có là cột sắc ký Waters Reliant C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm).
3.2.2. Lựa chọn pha động
Dựa vào tính chất phân cực log P (5,37; 1,87; 2,93) và giá trị pKa (7,19; 8,17; 8,35) của rupatadin, methyl paraben và methyl paraben tiến hành lựa chọn pha động có thành phần đệm pH < 5,0 để ba chất chất phân tích khơng bị chuyển dạng ion trong dung dịch, có thể được lưu giữ và rửa giải theo thời gian khác nhau. Cụ thể như sau:
Bảng 3. 1: Các hệ pha động đã tiến hành khảo sát
Tên pha
động
Thành phần pha động Tỷ lệ pha
động
Tình trạng
Pha động 1 Acetonitril : đệm phosphat (KH2PO4
0,05 M, pH 4,5) 60:40
Pic rupatadin đổ đầu Độ tinh khiết không đạt Pha động 2 Acetonitril : đệm phosphat (KH2PO4
0,05 M, pH 4,5) 50:50
Rupatadin giảm thời gian lưu theo thời gian Pha động 3
Acetonitril : methanol : đệm
phosphat (KH2PO4 pH 3,0) 30:30:40
Pic rupatadin và methyl paraben vẫn còn gần nhau
Pha động 4 Acetonitril : đệm phosphat (KH2PO4
pH 3,0) 42:58
27
Pha động gồm Acetonitril và đệm phosphat (KH2PO4 0,05M) với tỉ lệ 60:40 được lựa chọn để khảo sát (tham khảo[15]). Tiến hành khảo sát chương trình đẳng dịng với pha động gồm Acetonitril và đệm phosphat 0,05M pH 4,5. Kết quả thu được như sau:
Hình 3. 1: Sắc ký đồ dung dịch thử tại hệ pha động 1
Từ hình ảnh sắc ký đồ thu được sau khi khảo sát tỷ lệ 60:40, pH 4,5 của dung dịch
đệm, thấy rằng: Tại pha động này: có xuất hiện pic của ba chất phân tích với thời gian lưu
hợp lý. Tuy nhiên, pic rupatadin có hiện tượng đổ đầu hệ số đối xứng thấp (0,87), đồng thời độ tinh khiết không đạt (purity angle > purity threshold).
Khảo sát với tỷ lệ Acetonitril giảm xuống, đồng thời tỷ lệ đệm phosphat: ACN : đệm phosphat (KH2PO4 0,05M, pH 4,5) = (50:50) (tt/tt) . Thu được kết quả:
28
Nhận thấy, 3 pic thu được có thời gian lưu hợp lý, hệ số đối xứng, độ phân giải và độ tinh khiết đều đạt. Vì vậy, tiến hành thẩm định với pha động này. Trong quá trình thẩm định các các mũi tiêm ban đầu cho sắc kí đồ và các thơng số giống với quá trình khảo sát. Tuy nhiên, kết quả trên khơng lặp lại, vì vậy pha động 2 khơng phù hợp để tiếp tục nghiên cứ. Khảo sát với pha động 3 thành phần ACN : methanol : đệm phosphat (KH2PO4 pH 3,0) = (30:30:40) (tt/tt). Thu được kết quả (như hình 3.3), 2 pic rupatadin và methyl paraben vẫn còn gần nhau (với độ phân giải Rs= 2,4)
Tiến hành khảo sát và điều chỉnh tỷ lệ pha động phù hợp với điều kiện thiết bị với pha động ACN : đệm phosphat (KH2PO4, pH 3,0) = (42:58) (tt/tt) (tham khảo [10]). Thu được kết quả:
Hình 3. 4: Sắc ký đồ dung dịch thử tại hệ pha động 4
Nhận thấy, với chương trình trên ở trên các chất phân tích có pic tách hồn tồn, độ tinh khiết đạt và thời gian lưu hợp lý.
29
3.2.3. Lựa chọn bước sóng phát hiện
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện rupatadin, methyl paraben và propyl paraben, thực hiện quét phổ UV mẫu chuẩn hỗn hợp của ba chất ở dải bước sóng 200-800 nm. Mẫu chuẩn hỗn hợp được chuẩn bị theo quy trình ở mục 2.3.2. Kết quả thu được như sau:
Hình 3. 5: Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn của mẫu rupatadin (pic 2- xanh
dương), methyl paraben (pic 1- đỏ) và propyl paraben (pic 3 - xanh lam)
Kết quả cho thấy cả hai chất methyl paraben và propyl paraben đều có cực đại hấp thụ tại bước sóng khoảng 255 nm, trong khi đỉnh cực đại hấp thụ của rupatadin ở 244 nm. Tuy nhiên, trong công thức tý lệ propyl paraben nhỏ nên để đảm bảo khoảng tuyến tính của propyl paraben ưu tiên chọn bước sóng 255 nm để có thể định lượng đồng thời 3 chất. Như vậy, qua quá trình khảo sát thực nghiệm, đã lựa chọn các điều kiện để định lượng đồng thời rupatadin, methyl paraben và propyl paraben trong chế phẩm siro như sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Water kết nối detector PDA - Cột sắc ký Waters Reliant C18 (4,6 x 250 mm, 5 µm)
- Pha động : Acetonitril : đệm phosphat (KH2PO4 0,025M, pH 3,0) = (42:58) - Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 μl - Nhiệt độ cột: 30oC - Bước sóng ghi: 255 nm
Với chương trình chạy như trên cho kết quả như sau: các pic tách tốt, độ tinh khiết tốt, thời gian lưu ổn định.
30