Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại phịng thí nghiệm Vi sinh vật Mơi trường và phịng thí nghiệm Vi sinh vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ. Thời gian từ tháng 10 đến tháng 11 năm 2012.
3.1. Phương tiện thí nghiệm 3.1.1.Vật liệu 3.1.1.Vật liệu
- Nước rỉ rác được lấy từ bãi rác Tân Long tỉnh Hậu Giang.
- Vi khuẩn khử đạm: Pseudomonas stutzeri D3b (Phịng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ)
- Vi khuẩn tích lũy lân: Bacillus subtilis DTT1 (Phịng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ)
- Vi khuẩn kết tụ sinh học: Enterobacter aerogenes dịng P11 (Phịng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ)
3.1.2. Dụng cụ, trang thiết bị
Sử dụng dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu của phịng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ:
Ống nghiệm, tuýp Eppendorf, đĩa petri. Pippets, Micro-pipets.
Cốc thủy tinh, bình tam giác các loại. Keo nhựa (dung tích 1 lít).
Máy đo quang phổ. Máy lắc.
Cân điện tử.
Máy Vortex, máy đo pH. Máy sục khí.
Tủ sấy, tủ lạnh, tủ ủ.
3.1.3. Hĩa chất
3.1.3.1. Mơi trường nuơi vi khuẩn khử đạm
Bảng 3: Hĩa chất pha 1 lít mơi trường nuơi vi khuẩn khử đạm
Thành phần G K2HPO4 14g KH2PO4 6g Glucose 20g (NH4)2SO4 6g MgSO4.7H20 0.2g Yeast extract 0.5g
Vi lượng: 2 ml/l mơi trường (EDTA: 57,1 g/l, ZnSO4.7H2O: 3,9 g/l, CaCl2: 7 g/l,
MnCl2.3H2O: 5,1 g/l, FeSO4.7H2O: 5,0 g/l, (NH4)6MoO29.7H2O: 1,1 g/l, CuSO4.5H2O: 1,6 g/l, CoCl2.5H2O: 1,6 g/l).
(Nguồn: Hung-soo-joo., 2006)
3.1.3.2. Mơi trường nuơi vi khuẩn tích lũy lân
Bảng 4: Hĩa chất pha 1 lít mơi trường nuơi vi khuẩn tích lũy lân
Thành phần g, ml Acetate 5 g Glucose 0,5 g Succinate 0,5 g CaCl2 NH4Cl KH2PO4 Pepton MgSO4.7H2O 0,005 g 0,02 g 0,088 g 0,5 g 0,01 g Stock 0,5 ml Yeast extract 0,5 g
FeCl3.6H2O: 1,5 g/l H3BO3: 0,15 g/l CuSO4.5H2O: 0,03 g/l KI: 0,18 g/l MnCl2.4H2O: 0,12 g/l Na2MoO4.2H2O: 0,06 g/l ZnSO4.7H2O: 0,12 g/l CoCl2.6H2O: 0,15 g/l
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA): 10 g/l
3.1.3.3. Mơi trường nuơi vi khuẩn kết tụ sinh học protein
Bảng 5: Hĩa chất pha 1 lít mơi trường nuơi vi khuẩn kết tụ sinh học protein
Thành phần g, ml
Glucose 20g
L- Acid glutamic 50g
MgSO4.7H2O 0,5g
Yeast extract 0,5 g
(Nguồn: Hazana et al., 2008)
3.1.3.4. Các hĩa chất sử dụng để đo đạm
Dung dịch EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O - Ethylene diamine tetraacetic aicd disodium salt) hịa tan 6g EDTA với 100ml H2O.
Dung dịch Phenol-sodium nitroprusside dihydrate : hịa tan 7g phenol (C6H5OH) và 0,034g sodium nitroprusside dihydrate (Na2(Fe(CN)5NO.2H2O) thêm nước đủ 100ml (50ml H2O + phenol + sodium nitroprusside dihydrate + 50ml H2O), dung dịch này được bảo quản lạnh.
Dung dịch Sodium hypochloride: hịa tan 4,98g Na2HPO4, 1,48g NaOH và 20ml NaOCl thêm nước đủ 100ml.
Dung dịch đạm chuẩn N-NH4 1 mg/l.
3.1.3.5. Các hĩa chất sử dụng để đo lân
Dung dịch A: 6g/l (NH4)Mo2O24.4H2O, 0,1454g/l KsbOC4H4O6, 500ml H2SO4 5N (70ml H2SO4 + 500ml H2O).
Dung dịch B: 200ml dung dịch A + 1,056g acid ascorbic. Dung dịch đạm chuẩn P-P2O5 10 mg/l.
3.1.3.6. Các hĩa chất sử dụng để keo tụ, lọc
Poly Aluminium Chloride ( PAC) polymer A – Anionic
Than hoạt tính
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Thí nghiệm 1: Keo tụ nước rỉ rác sau xử lý vi khuẩn khử Đạm, Lân
Mục đích: keo tụ nước rỉ rác đã qua quá trình xử lý vi khuẩn khử Đạm, Lân. Chuẩn bị:
- Thu nước rỉ rác đã qua quá trình xử lý vi khuẩn khử đạm, lân từ thí nghiệm ứng dụng vi khuẩn xử lý nước rỉ rác theo mơ hình bùn hoạt tính và kết hợp giá bám vi sinh vật thể tích 100 lít, nước được lấy từ các nghiệm thức NT2 [Bùn hoạt tính] và NT3 [Bùn hoạt tính + Giá bám] ở ngày thứ 12 của thí nghiệm.
- Nuơi dịng vi khuẩn kết tụ sinh học
+ Mỗi dịng vi khuẩn được nuơi trong 50ml mơi trường lỏng trong bình tam giác 100ml (mơi trường dùng để phân lập khơng bổ sung agar).
+ Lắc bằng máy lắc 150 vịng/phút.
+ Nuơi trong 3 ngày ở nhiệt độ phịng cho vi khuẩn phát triển sản sinh kết tụ sinh học và được sử dụng cho các thí nghiệm sau.
Bảng 6: Bố trí thí nghiệm 1
Nghiệm thức Phương pháp keo tụ Thể tích Số lần lặp
Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Đối chứng Vi khuẩn kết tụ (1ml/L) PAC (2,5g/L) 5 lít 5 lít 5 lít 3 lần 3 lần 3 lần
Nghiệm thức 4 PAC (2,5g/L) + Polymer (0,01g/L) 5 lít 3 lần
Nghiệm thức 5 PAC (2,5g/L) + Vi khuẩn kết tụ (1ml/L) 5 lít 3 lần Mơ tả thí nghiệm:
- Nghiệm thức 1: Nước rỉ rác đã qua quá trình xử lý vi khuẩn khử đạm, lân cho vào keo nhựa để yên trong 30 phút thu mẫu nước đem phân tích các chỉ tiêu.
- Nghiệm thức 2: Nước đã qua quá trình xử lý vi khuẩn khử đạm, lân được cho vào keo nhựa 5 lít. Thêm vi khuẩn kết tụ 1ml/lít khuấy đều trong 1 phút, để yên trong 30 phút cho kết tụ, thu phần nước trong đem phân tích các chỉ tiêu.
- Nghiệm thức 3: Nước đã qua quá trình xử lý vi khuẩn khử đạm, lân được cho vào keo nhựa 5 lít. Thêm PAC (2,5g/L) và khuấy đều trong 5 phút, để yên trong 30 phút cho keo tụ, thu phần nước trong đem phân tích các chỉ tiêu.
- Nghiệm thức 4: Nước đã qua quá trình xử lý vi khuẩn khử đạm, lân được cho vào keo nhựa 5 lít. Thêm PAC (2,5g/L) và khuấy đều trong 5 phút, sau đĩ thêm Polymer (0,01g/L) rồi khuấy tiếp 1 phút, để yên trong 30 phút cho keo tụ, thu phần nước trong đem phân tích các chỉ tiêu.
- Nghiệm thức 5: Nước đã qua quá trình xử lý khuẩn khử Đạm, Lân được cho vào keo nhựa 5 lít. Thêm PAC (2,5g/L) và khuấy đều trong 5 phút, sau đĩ thêm vi Khuẩn kết tụ (1ml/L) rồi khuấy tiếp 1 phút, để yên trong 30 phút cho keo tụ, thu phần nước trong đem phân tích các chỉ tiêu.
Tất cả các nghiệm thức đều được lặp lại 3 lần
3.2.3. Thí nghiệm 2: Lọc nước sau keo tụ xử lý ở thí nghiệm 1
Mục đích : Loại bỏ các tạp chất cịn sĩt lại Chuẩn bị :
- Thu nước sau keo tụ xử lý ở nghiệm thức cho kết quả tốt nhất trong thí nghiệm 1 - Cỏ Vetiver và Năng trồng trong cát ở thùng dung tích 10 lít
- Than hoạt tính, cát
- Thùng dung tích 10 lít cĩ vịi dưới xả nước
Bảng 7: Bố trí thí nghiệm 2
Nghiệm thức Phương pháp lọc Lưu lượng Số lần lặp
Nghiệm thức 1 Đối chứng 2 lít/ngày 3 lần
Nghiệm thức 2 Cát 2 lít/ngày 3 lần
Nghiệm thức 3 Than hoạt tính 2 lít/ngày 3 lần
Nghiệm thức 4 Cỏ Vetiver trồng trong cát 2 lít/ngày 3 lần
Nghiệm thức 5 Cỏ Năng trồng trong cát 2 lít/ngày 3 lần
Mơ tả thí nghiệm: Cĩ 5 nghiệm thức, lặp lại 3 lần, lưu lượng lọc 2 lít/ngày, theo dõi trong 10 ngày. Thu phần nước qua q trình lọc phân tích các chỉ tiêu đến ngày 10.
- Nghiệm thức 1: Nước sau keo tụ xử lý ở thí nghiệm 1 sử dụng làm nguồn nước châm.
- Nghiệm thức 2: Cho 10kg cát vào thùng dung tích 10 lít cĩ vịi dưới xả nước. Nước sau quá trình xử lý keo tụ từ Thí nghiệm 1 cho vào 2 lít/ngày.
- Nghiệm thức 3: Cho 2kg than hoạt tính vào thùng dung tích 10 lít cĩ vịi dưới xả nước. nước sau q trình xử lý keo tụ từ thí nghiệm 1 cho vào 2 lít/ngày.
- Nghiệm thức 4: Nước sau keo tụ xử lý từ thí nghiệm 1 cho vào mơ hình lọc cỏ vetiver trồng trong cát lưu lượng 2 lít/ngày.
- Nghiệm thức 5: Nước sau keo tụ xử lý từ thí nghiệm 1 cho vào mơ hình lọc cây năng trồng trong cát lưu lượng 2 lít/ngày.
3.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hĩa lý 3.3.1. Đo pH 3.3.1. Đo pH
Tiến hành theo dõi pH trong tất cả các nghiệm thức mỗi ngày bằng máy đo pH: Hiệu chỉnh pH về giá trị trung tính (pH = 7) bằng các dung dịch pH chuẩn
Mỗi nghiệm thức lấy khoảng 5ml bằng cách rĩt mẫu vào ly nhựa (tránh làm nhiễm các mẫu với nhau).
Đặt điện cực của điện kế vào mẫu cần đo, ghi lại kết quả. Sau mỗi lần đo phải rửa điện cực thật sạch bằng nước cất rồi lau khơ bằng giấy mềm.
3.3.2. Đo đạm theo phương pháp Indophenol Blue
Tiến hành đo nồng độ ammonium tất cả các nghiệm thức trong thí nghiệm mỗi ngày. Xác định hàm lượng NH4+ trong mơi trường để đánh giá khả năng khử đạm của các chủng vi khuẩn bằng cách so màu trên máy quang phổ kế Spectrophotomecter tại bước sĩng 636 nm, dựa vào phương pháp Indophenol Blue (Keeney Nelson, 1982) theo nguyên tắc:
NH4+ + Phenol Hypochloride ion (mơi trường kiềm) Indophenol (cĩ màu xanh)
Các bước tiến hành đo đạm:
Bước 1: Dựng dãy đường chuẩn (gồm 6 ống nghiệm 20ml): hút lần lượt 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0 ml nước cất cho vào 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5. Cho lần lượt 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml dung dịch đạm chuẩn cĩ hàm lượng 1 mg/l N-NH4+. Thêm lần lượt 0,5 ml dung dịch EDTA, 1ml dung dịch Phenol-Sodium nitroprusside và 2 ml dung dịch Sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Khi đĩ ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0-1-2-3-4-5 mg/l NH4+.
Bảng 8: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+
Hĩa chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Dung dịch NH4+ chuẩn (1 mg/l) 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml Nước khử khống 2,5 ml 2 ml 1,5 ml 1 ml 0,5 ml 0 ml EDTA 0,5ml Phenol-sodium nitroprusside 1ml Sodium hypochloride 2 ml
Bước 2: hút 2 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch mẫu nước thải (ly tâm 10000 vịng/phút trong 5 phút). Thêm lần lượt 0,5 ml dung dịch EDTA, 1ml dung dịch Phenol- Sodium nitroprusside và 2 ml dung dịch Sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Để ổn định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phịng
Bước 3: Đo NH4+
Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sĩng 636 nm.
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lượng NH4+ trước, sau đĩ đo OD các nghiệm thức.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (khơng cĩ NH4+, khơng cĩ màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo OD 5 ống nghiệm cịn lại. Năm ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt cĩ giá trị NH4+ là 1, 2, 3, 4, 5 mg/l cĩ màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Excel để thiết lập phương trình đường chuẩn NH4+. Dựa vào phương trình đường chuẩn: A = a*C + b
Trong đĩ: C là hàm lượng đạm của mẫu (mg/l) A là độ hấp thụ quang (OD636nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn NH4+ và giá trị OD636nm của mẫu để tính hàm lượng đạm cĩ trong mẫu tương ứng với lượng NH4+ theo cơng thức: C = (A – b)/a
3.3.3. Phương pháp đo lân
Dựng dãy đường chuẩn (gồm 6 ống nghiệm 20ml): cho 6 ml nước khử khống vào cả 6 ống nghiệm, hút lần lượt 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0 ml nước khử khống cho vào 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5. Cho lần lượt 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml dung dịch lân chuẩn cĩ hàm lượng 10 mg/l P-P2O5. Thêm 4ml dung dịch B vào mỗi ống nghiệm, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Ống đầu tiên là mẫu blank. Khi đĩ ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0-10-20-30-40-50 mg/l P2O5.
Bảng 9: Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5
Hĩa chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5
Nước khử khống 6ml
Dung dịch P2O5 chuẩn (10 mg/l) 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml Nước khử khống 2,5 ml 2 ml 1,5 ml 1 ml 0,5 ml 0 ml
Dung dịch B 4 ml
Cách đo mẫu nước thải: 8 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch mẫu nước thải. Thêm 4ml dung dịch B vào mỗi ống nghiệm, trộn đều dung dịch trên máy Vortex.
Để ổn định 20 phút ở nhiệt độ phịng.
Tiến hành đo lân trong mẫu ở bước sĩng 880nm.
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phương trình đường chuẩn của P2O5. Phương trình đường chuẩn cĩ dạng: Y = a*X + b
Trong đĩ: X là nồng độ của mẫu (mg/l) Y là độ hấp thụ quang (OD880nm)
Dựa vào phương trình đường chuẩn P2O5 và giá trị OD880nm của mẫu để tính hàm lượng lân cĩ trong mẫu tương ứng với lượng P2O5 theo cơng thức: X = (Y – b)/a
Từ hàm lượng lân cĩ trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5, tính hàm lượng PO43- dựa theo cơng thức:
(Trong đĩ: C là hàm lượng Lân cĩ trong mẫu tương ứng với hàm lượng P2O5 = 142 ; = 95)
3.3.4. Tổng đạm (TKN) và tổng lân (TP) (phương pháp Kjeldahl) Nguyên tắc: Nguyên tắc:
Các dạng đạm hữu cơ bị oxy hĩa bởi acid H2SO4 đậm đặc với xúc tác K2SO4 và CuSO4 hoặc H2O2 trong điều kiện nhiệt độ cao (375-385oC) sẽ chuyển hĩa hồn tồn thành đạm ammonium (NH4+). Ammonia (NH3) cũng chuyển thành ammonium. Sau khi thêm vào dung dịch bazơ, ammonia được hịa tan trong mơi trường kiềm và bị hấp thu bởi
M PO4 P2O5 M = PO43- C x M PO4 P2O5 M
acid boric hay acissulfuric, ammonia cĩ thể được xác đinh bằng phương pháp so màu quang phổ Indophenol blue. Các dạng lân hữu cơ cũng bị oxy hĩa (trong điều kiện tương tự như đạm hữu cơ) sẽ chuyển hĩa thành orthophosphate. Orthophosphate cĩ thể được xác định bằng phương pháp so màu quang phổ ascorbic acid hay xanh molypden.
Do đĩ, để phân tích tổng đạm (TKN) và tổng lân (TP) chúng ta cĩ thể thực hiện cơng phá trên cùng một mẫu, sau đĩ mới tiến hành phân tích hai chỉ tiêu trên theo các phương pháp dùng phân tích các dạng muối đạm và lân vơ cơ hịa tan.
Phương pháp đo tổng đạm
Nguyên tắc:
Khi đun mẫu vật cĩ chứa nitơ trong H2SO4 đậm đặc với chất xúc tác thích hợp thì tất cả các hợp chất hữu cơ bị oxy hố, carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O. Nitơ phĩng thích dưới dạng NH3 và kết hợp với H2SO4 tạo thành muối (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
Hợp chất chứa nitơ (N) (NH4)2SO4
Chưng cất, đuổi nitơ ra khỏi dung dịch (NH4)2SO4 dưới dạng NH3 bằng NaOH, hấp thu NH3 bằng dung dịch acid boric (H3BO3) với chất chỉ thị màu (hỗn hợp bromresol green và methyl red) tạo thành muối ammonium tetraborat.
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH3 + 2H2O 2NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
Sau đĩ định phân lượng nitơ trong dung dịch (NH4)2B4O7 bằng dung dịch acid mạnh H2SO4 0,05N (chuẩn) đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang màu đỏ nâu.
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3 Hĩa chất:
Chất xúc tác vơ cơ hĩa mẫu: Nghiền mịn và trộn đều theo tỉ lệ như sau: 100g K2SO4: 10g CuSO4: 1g Se
Hỗn hợp chất chỉ thị màu: Cân 0,099 bromoresol green và 0,666g methyl red hịa tan trong 100 ml ethanol.
Dung dịch acid boric _chỉ thị màu: Cân 20g acid boric (H3BO3) hịa tan trong 950 ml nước cất, sau đĩ cho 20 ml dung dịch chất chỉ thị màu khuấy đều, cho tham nước cất vào cho vừa đủ 1 lít (dung dịch cĩ màu đỏ). Dung NaOH 0,1N điều chỉnh màu của dung dịch về màu đỏ nâu sắp chuyển sang màu xanh (pH 5) (Bremner, 1970).
Dung dịch NaOH 10N: Cân 400g NaOH hịa tan trong nước cất cho vừa đủ 1 lít chứa trong bình kín hạn chế tiếp xúc khí CO2.
Dung dịch H2SO4 0,05N.
Cách tiến hành:
Vơ cơ hố mẫu
Cho vào bình kjeldahl lần lượt 0,5ml mẫu, 5ml H2SO4 đậm đặc, 0,5g chất xúc tác vơ cơ hố. Tráng bình kjeldahl một vịng bằng nước cất, sau đĩ đem đun trong tủ hút độc đến khi dung dịch trong suốt hay cĩ màu xanh lơ. Để nguội cho vào một ít nước cất, dung dịch trong suốt hay cĩ màu xanh lơ của CuSO4 thì mẫu đã bị vơ cơ hố hồn tồn, nếu dung dịch cĩ hạt màu đen thì ta tiếp tục đun.
Song song với mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử khơng (thay lượng mẫu bằng