3.1.1 .Vật liệu
3.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hĩa lý
3.3.2. Đo đạm theo phương phápIndophenol Blue
Tiến hành đo nồng độ ammonium tất cả các nghiệm thức trong thí nghiệm mỗi ngày. Xác định hàm lượng NH4+ trong mơi trường để đánh giá khả năng khử đạm của các chủng vi khuẩn bằng cách so màu trên máy quang phổ kế Spectrophotomecter tại bước sĩng 636 nm, dựa vào phương pháp Indophenol Blue (Keeney Nelson, 1982) theo nguyên tắc:
NH4+ + Phenol Hypochloride ion (mơi trường kiềm) Indophenol (cĩ màu xanh)
Các bước tiến hành đo đạm:
Bước 1: Dựng dãy đường chuẩn (gồm 6 ống nghiệm 20ml): hút lần lượt 2,5; 2; 1,5; 1; 0,5; 0 ml nước cất cho vào 6 ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5. Cho lần lượt 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 ml dung dịch đạm chuẩn cĩ hàm lượng 1 mg/l N-NH4+. Thêm lần lượt 0,5 ml dung dịch EDTA, 1ml dung dịch Phenol-Sodium nitroprusside và 2 ml dung dịch Sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Khi đĩ ta được đường chuẩn với hàm lượng các ống theo thứ tự tăng dần là 0-1-2-3-4-5 mg/l NH4+.
Bảng 8: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+
Hĩa chất Ống 0 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Dung dịch NH4+ chuẩn (1 mg/l) 0 ml 0,5 ml 1 ml 1,5 ml 2 ml 2,5 ml Nước khử khống 2,5 ml 2 ml 1,5 ml 1 ml 0,5 ml 0 ml EDTA 0,5ml Phenol-sodium nitroprusside 1ml Sodium hypochloride 2 ml
Bước 2: hút 2 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch mẫu nước thải (ly tâm 10000 vịng/phút trong 5 phút). Thêm lần lượt 0,5 ml dung dịch EDTA, 1ml dung dịch Phenol- Sodium nitroprusside và 2 ml dung dịch Sodium hypochloride vào mỗi ống, trộn đều dung dịch trên máy Vortex. Để ổn định 15 – 20 phút ở nhiệt độ phịng
Bước 3: Đo NH4+
Bật máy quang phổ khoảng 30 phút trước khi đo, hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ hấp thu màu (OD) ở bước sĩng 636 nm.
Đo giá trị OD ở 6 ống nghiệm đã biết hàm lượng NH4+ trước, sau đĩ đo OD các nghiệm thức.
Sử dụng giá trị OD của ống số 0 (khơng cĩ NH4+, khơng cĩ màu xanh) làm mẫu blank đưa giá trị OD về 0, tiến hành đo OD 5 ống nghiệm cịn lại. Năm ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 lần lượt cĩ giá trị NH4+ là 1, 2, 3, 4, 5 mg/l cĩ màu xanh đậm dần sẽ tương ứng với 5 giá trị OD tăng dần.
Sử dụng phần mềm Excel để thiết lập phương trình đường chuẩn NH4+. Dựa vào phương trình đường chuẩn: A = a*C + b
Trong đĩ: C là hàm lượng đạm của mẫu (mg/l) A là độ hấp thụ quang (OD636nm).
Dựa vào phương trình đường chuẩn NH4+ và giá trị OD636nm của mẫu để tính hàm lượng đạm cĩ trong mẫu tương ứng với lượng NH4+ theo cơng thức: C = (A – b)/a