Tế bào vi tảo chuyển sang giai đoạn bào nang khi gặp điều kiện bất lợi, lúc này q trình tích lũy astaxanthin bắt đầu diễn ra trong nhân tế bào, khi trở thành bào nang trưởng thành thì tế bào có màu đỏ (Kobayshi, 1997).
Cách tiến hành: Sử dụng kính hiển vi để theo dõi sự thay đổi kích thước, hình thái và màu sắc trong tế bào H. pluvialis từ khi bắt đầu quá trình gây stress. Quá trình này sẽ dừng lại khi tế bào phát triển thành bào nang trưởng thành.
21
2.5. Chỉ tiêu theo dõi
Đối với tất cả các cơng thức thí nghiệm, mẫu được lấy 2 ngày/lần để xác định các thông số.
- Tốc độ sinh trưởng của tảo.
- Hàm lượng sắc tố chlorophyll a và carotenoid - Trong lượng khô của tảo
2.6. Phương pháp xác định mật độ tế bào
Mật độ tế bào: được đếm bằng buồng đếm hồng cầu. Lắc đều mẫu cần đếm, pha loãng nếu cần thiết. Tiến hành đếm trên cả 16 ô lớn trong buồng đếm. Mật độ tế bào được tính theo cơng thức:
D = A . n . 104 Trong đó: D: mật độ tế bào (TB/mL)
A: Tổng số tế bào trong cả buồng đếm n: Hệ số pha lỗng (nếu có)
2.7. Phương pháp định lượng hàm lượng sắc tố
Hàm lượng sắc tố chlorophyll a carotenoid (Nguyễn Đức Lượng, 2013): ly tâm 0,5 – 2 mL dịch tảo trong một eppendorf 2 mL (16000 vòng/phút, 5 phút). Loại bỏ dịch, bổ sung 1 mL aceton 90% và bi, cho vào máy nghiền bi, phá mẫu tảo với tần số 30 s-1 trong 60 phút. Ly tâm 16000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch, định mức dịch thu được. Phần dịch trong được đo với các bước sóng 665, 645, 630 và 480 nm (tồn bộ q trình được tiến hành trong tối). Hàm lượng các sắc tố được tính bằng cơng thức sau:
Hàm lượng sắc tố (μg/l) = C/V
V: lượng thể tích dịch tảo đem lọc (lít) C: giá trị nhận được từ các công thức sau
C (chlorophyll a) = 11,6 * E665 – 1,31 * E645 – 0,14 * E630 C (carotenoid tổng số) = 4,0 * E480
Với Ei: là giá trị OD đo được ở bước sóng i.
Định lượng astaxanthin theo hàm lượng carotenoid: Ở vi tảo H. pluvialis,
22
sóng 480 nm. Vì vậy, hàm lượng carotenoid ở tảo H. pluvialis được xem chính là
hàm lượng của astaxanthin (Jeffrey và ctv, 1997.).
2.8. Phương pháp phân tích trọng lượng khơ của tảo
Trọng lượng khô của tảo (TLK, g/l) được xác định thông qua giá trị của mật độ quang đo được trên máy quang phổ:
TLK (mg/ml) = 3,04 x (OD750 – OD680) / OD680 + 1,40 x OD680
2.9. Phương pháp xử lý số li u
Số liệu ghi nhận được xử lí bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2007 và được phân tích theo trắc nghiệm Turkey với độ tin cậy 95% bằng phần mềm Minitab 16 để so sánh sự khác nhau giữa các nghiệm thức.
23
CHƯƠNG III