38
3.3.3 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo mẻ cấy theo mẻ
Sau khi tiệt trùng hệ thống bằng đèn UV trong 30 phút, chuẩn bị các giống thế hệ F2, tiến hành các thí nghiệm:
* Thí nghiệm 1: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng môi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng và điều chỉnh ở pH7. Gia nhiệt ở 3 khoảng nhiệt độ là 30OC, 40OC, 50OC. Mỗi khoảng nhiệt độ cài đặt trong 24 giờ. Đánh giá hiệu quả nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn.
* Thí nghiệm 2: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng môi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng. Cài đặt nhiệt độ ở 30OC. Điều chỉnh pH với các giá trị pH 5, 6, 7, 8. Mỗi khoảng pH ổn định trong 24h. Đánh giá hiệu quả nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn. * Thí nghiệm 3: Sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng môi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng. Cài đặt nhiệt độ 30OC, pH 7, đánh giá hiệu quả nuôi cấy thông qua mật độ vi khuẩn vào thời điểm từ 6 giờ đến 48 giờ.
Trong đó, Thí nghiệm 1 đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ của bộ gia nhiệt. Thí nghiệm 2 đánh giá khả năng ổn định pH của đầu dị. Thí nghiệm 3 đánh giá sự ổn định của hệ thống sau khoảng thời gian dài ni cấy. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và tiến hành ở hai mức thể tích 3 lít và 8 lít nhằm đánh giá khả năng ổn định của hệ thống ở tất cả các vị trí bên trong lịng ngăn chứa dịch nuôi cấy. Đồng thời kiểm tra khả năng pha trộn dung dịch của hệ thống sục khí ở các mức thể tích thấp và cao.
3.3.4 Thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định của hệ thống khi nuôi cấy liên tục tục
Sau khi tiệt trùng hệ thống bằng đèn UV trong 30 phút, sử dụng giống vi khuẩn Bacillus cho vào hệ thống cùng 5 lít mơi trường cao thịt peptone đã tiệt trùng. Cài đặt nhiệt độ 30OC, pH 7. Sau mỗi 5 giờ, mở van xả thu nhận 1 lít sản phẩm sau ni cấy và đồng thời mở van nạp để bổ sung vào 1 lít mơi trường mới. Tiến hành 4 lần. Đánh giá hiệu quả thông qua mật độ vi khuẩn thu nhận được trong sản phẩm.
39 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả thiết kế hệ thống bioreactor
Theo các tính tốn trên phần mềm thiết kế, để đạt được thể tích mong muốn từ 2 đến 10 lít và tỷ lệ chiều cao trên đường kính của thùng lên men hợp lý, hệ thống bioreactor lựa chọn thông số chiều dài 530cm, chiều rộng 280cm, chiều cao 700cm bao gồm 2 ngăn nối liền với nhau. Ngăn 1 là tủ điện, nơi lưu thơng khí để tản nhiệt vào xung quanh thành của ngăn 2. Phía trên là hệ thống điều khiển có màn hình thể hiện ngày giờ, nhiệt độ, pH, công tắc đèn UV, van điều chỉnh lưu lượng khí. Bộ phận gia nhiệt được đặt bên dưới cùng quạt làm mát Ngăn 2 là nơi chứa dịch nuôi cấy, có ống dẫn khí, van xả bên dưới; van bổ sung dinh dưỡng bên hơng (hình 4.1).
Hình 4.1 Bản vẽ hệ thống bioreactor
Đối tượng sử dụng chính của hệ thống bioreactor là các chủng vi khuẩn hiếu khí. Để đảm bảo q trình ni cấy thu nhận được đúng chủng vi khuẩn mục tiêu, hệ thống đèn UV được bố trí ở nắp đậy của ngăn 2, công tắc ở bộ điều khiển của ngăn 1.
Lựa chọn phương pháp gia nhiệt qua thành để giảm thiểu sự ảnh hưởng đến tế bào, nên bộ phận gia nhiệt được đặt bên dưới ngăn 1, cùng với hệ thống quạt làm mát, lưu thơng khơng khí để tản nhiệt vào ngăn 2. Cảm biến nhiệt PT100 (dòng sản phẩm TF101U2) sử dụng trong hệ thống là một đầu dò chuyển đổi nhiệt độ tại khu vực đo được thành tín hiệu điện ở đầu ra. Đầu dị nhiệt độ có điện trở làm bằng bạch kim (platinum) có độ chính xác cao, chịu được áp lực, chống rung, thích hợp sử dụng trong các dung dịch lỏng có khuấy trộn. Bao bọc bên ngồi là vỏ thép khơng rỉ V4A cùng lớp bảo vệ IP66. Đối với pH, hệ thống dùng đầu dò của hãng Atlas Scientific biên độ đo 0-14 đặt dưới đáy của ngăn 2. Đầu dò được bọc
40 một lớp màng mỏng bằng thủy tinh cho phép ghi nhận sự khác biệt nồng độ ion H+ bên trong và ngồi màng. Từ sự khác biệt đó, đầu dị xác định giá trị pH tương quan (Hình 4.2).
Hình 4.2 Cảm biến nhiệt độ và đầu dò pH sử dụng trong hệ thống
Với thể tích nhỏ nên hệ thống không sử dụng cánh khuấy mà tận dụng q trình sục khí để tạo dịng pha trộn dung dịch với tế bào ni cấy. Ống sục khí được đặt dưới đáy ngăn 2 có van điều chỉnh tốc độ sục khí. Ngồi ra, cịn có van nạp để bổ sung nguyên liệu, dung dịch dinh dưỡng từ phía hơng và van xả để lấy bớt sản phẩm sau nuôi cấy được đặt phía dưới ngăn 2. Cả hai van này thông trực tiếp vào dung dịch nuôi cấy bên trong ngăn 2, phục vụ cho q trình ni cấy theo mẻ mà không cần mở nắp ngăn.
Về nguyên vật liệu lựa chọn, có hai loại trong thiết kế bioreactor là thủy tinh và inox. Bioractor bằng thủy tinh trong suốt có ưu điểm đẹp, chịu nhiệt tốt, có thể quan sát được dung dịch bên trong, dễ vệ sinh. Tuy nhiên giá thành cao, dễ vỡ trong q trình vận chuyển và khó gia cơng các van, ống dẫn. Nếu sử dụng thì các ống dẫn, đầu dị sẽ được thiết kế trên nắp bằng inox. Bioractor bằng inox hay cịn gọi là thép khơng gỉ có ưu điểm giá thành thấp, độ bền cao, có thể thiết kế bất kỳ van ống dẫn nào dọc theo thành hệ thống. Mặc khác, vẫn có khả năng chịu nhiệt tốt và dễ dàng trong quá trình vận chuyển, sử dụng (hình 4.3).
Inox 304 hay cịn gọi là thép khơng gỉ có thành phần chủ yếu là Crom (Cr), Niken (Ni), có độ cứng, độ bền cao, bề mặt sáng bóng, khơng gỉ sét. Đặc biệt, Inox 304 có khả năng chống ăn mịn và chiu nhiệt tốt, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Inox 316 ngồi Crom (Cr), Niken (Ni) cịn có thêm Molybdenum có khả năng chống ăn mòn cao hơn inox 304, chịu nhiệt lên đến 500 độ C nên sử dụng trong những điều kiện môi trường khắc nghiệt hơn như những vùng ven biển, muối làm tan băng, những giải pháp ngâm nước muối, hoá chất. Tuy nhiên, giá thành của inox 316 lại cao hơn, độ chịu lực thấp hơn, nhiệt độ nóng chảy cao hơn nên chi phí tạo hình sản phẩm lớn.
41 Hình 4.3 Bioreactor bằng thủy tinh và inox
42 Sau khi so sánh giữa 3 loại vật liệu, nghiên cứu lựa chọn inox 304 cho thiết kế. Quá trình được thực hiện tại Trung tâm đào tạo cơng nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh. Sau đó, hệ thống bioreactor được vận chuyển về phịng thí nghiệm sinh học mơi trường, Viện KHCN&QL Môi trường cho các thử nghiệm đánh giá tiếp theo (Hình 4.4).
Hình 4.5 Màn hình ứng dụng Bioreactor HC-06 Các bước vận hành như sau: Các bước vận hành như sau:
Bước 1: Bật đèn UV trong 30 phút để khử trùng hệ thống
Bước 2: Cho môi trường dinh dưỡng và giống vi sinh vật
Bước 3: Bật Bluetooth trên điện thoại Chọn thiết bị kết nối “choose a devide” chọn CONNECT (HC- 06)
Bước 4: Chọn chế độ AUTO hoặc MANUAL
Bước 5: Cài nhiệt độ muốn nuôi cấy – set temperature Bước 6: Cài thời gian nuôi cấy – Alam Time (phút) Bước 7: Chạy mơ hình – RUN
43 Ngoài ra, để tăng thêm hiệu quả và thuận tiện trong quá trình sử dụng, phần mềm Bioreactor HC-06 dùng điều khiển hệ thống thông qua kết nối bluetooth với điện thoại thông minh. Phần mềm do nhóm thiết kế thuộc Trung tâm nghiên cứu công nghệ caoTpHCM thiết kế và bàn giao cho nhóm nghiên cứu. Phần mềm có thể cài đặt trên điện thoại có hệ điều hành Adroid. Phần mềm có cài đặt chế độ tự động (AUTO) cho hệ thống hoặc chế độ điều khiển bằng tay (MANUAL). Chế độ tự động cho phép cài đặt nhiệt độ và thời gian. Chế độ điều khiển bằng tay cho phép cài đặt và điều chỉnh thêm chức năng sục khí, quạt và đèn UV (Hình 4.5).
Ưu điểm của phần mềm Bioreactor HC-06 là dễ dàng cài đặt trên tất cả điện thoại thông minh android, thao tác dễ sử dụng. Tuy nhiên nhược điểm là chỉ có thể kết nối với hệ thống bioreactor thông qua Bluetooth. Điều này làm giới hạn về khoảng cách kiểm soát cho người dùng.
4.2 Kết quả đánh giá vận hành hệ thống
4.2.1 Kết quả chuẩn bị giống
Theo quy trình ni cấy vi sinh vật trong các thiết bị bioreactor, chủng vi sinh vật sử dụng phải dưới dạng thuần và phải được nhân sinh khối với hàm lượng đủ lớn (trên 106 tế bào/ml) trước khi bổ sung vào hệ thống. Giống Bacillus nhận được từ Viện Sinh học thực phẩm, ĐH Công nghiệp TpHCM sau khi được kiểm tra độ thuần dưới kiến hiển vi, cấy truyền trên môi trường cao thịt peptone rắn đều cho kết quả tốt (Hình 4.7). Tế bào vi khuẩn hình que, khuẩn lạc trên mơi trường rắn màu trắng đục, lồi, mép nhăn.
(a) Khuẩn lạc trên môi trường thạch (b) Vi khuẩn Bacillus dưới kính hiển vi (c) Giống F2 trong mơi trường lỏng
44
4.2.2 Kết quả thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo mẻ
* Khả năng ổn định nhiệt độ
Mỗi tế bào vi sinh vật có một khoảng nhiệt độ và pH tối thích cho sự phát triển, vì vậy, đây là hai thơng số cần ổn định chính xác trong suốt thời gian nuôi cấy [7] Đối với nuôi cấy vi khuẩn, thông thường nhiệt độ tối ưu từ 25 – 35OC. Một số nhóm ưa nhiệt có thể cần ở nhiệt độ cao hơn từ 50 – 80OC [5]. Hệ thống được thiết kế theo phương pháp gia nhiệt qua thành nên thời gian để nhiệt độ phân tán đều cho tồn bộ dung dịch trong mơi trường tương đối chậm. Tuy nhiên, điều này làm giảm sự tác động đột ngột của nhiệt độ đến tế bào và giúp cho sự phân tác nhiệt trong dung dịch đều đặn ổn định hơn [6].
Kết quả theo dõi nuôi cấy chủng vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy sinh khối thu nhận được ở nhiệt độ 40OC là cao nhất, trung bình là 3,11x108 tế bào/ml ở thể tích ni cấy 3 lít và 3,45x108 tế bào/ml ở thể tích ni cấy 8 lít. Ở nhiệt độ 30OC và 50OC, sinh khối giảm đáng kể, còn 1,19 đến 1,22x108 tế bào/ml ở cả 2 mức thể tích (Bảng 4.1 và hình 4.8). Nghiên cứu về Bacillus của các tác giả ….. đều cho thấy nhiệt độ tối ưu của chủng vi khuẩn này là 37OC.
So sánh ở 2 mức thể tích, mật độ tế bào thu nhận được ở các khoảng nhiệt độ khơng có sự chênh lệch đáng kể. Điều này cho thấy sự sinh trưởng phát triển theo nhiệt độ của chủng vi khuẩn diễn ra đều khắp các vị trí trong dung dịch. Tuy nhiên, trong quá trình vận hành, nhận thấy khi thể tích từ 3 lít tăng lên 8 lít (gấp 2,35 lần) thì thời gian trung bình hệ thống gia nhiệt đến nhiệt độ cài đặt từ 15,1 phút tăng lên 36,1 phút (dài hơn gấp 2,39 lần). Việc gia nhiệt qua thành ở thể tích nhỏ 3 lít và thể tích lớn 8 lít chỉ có sự khác biệt về mặt thời gian, không làm ảnh hưởng đến việc phân bố nhiệt độ đều khắp toàn bộ dung dịch.
45 Bảng 4.1 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ
Nhiệt độ
3 lít 8 lít
Mật độ tế bào (*108 tb/ml)
Thời gian gia nhiệt (phút)
Mật độ tế bào (*108 tb/ml)
Thời gian gia nhiệt (phút) 30OC Lần 1 2,03 13 1,87 32 Lần 2 2,05 15 1,99 33 Lần 3 1,79 15 2,38 32 TB 1,96 14,3 2,08 32,3 40OC Lần 1 2,93 15 3,37 36 Lần 2 3,29 14 2,99 36 Lần 3 3,11 14 3,39 37 TB 3,11 14,3 3,25 36,3 50OC Lần 1 1,08 16 1,21 39 Lần 2 1,21 17 1,48 40 Lần 3 1,29 17 0,98 40 TB 1,19 16,7 1,22 39,7
Hình 4.8 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ * Khả năng ổn định pH * Khả năng ổn định pH
Trong q trình ni cấy, giá trị pH được theo dõi liên tục để giữ môi trường trong phạm vi tối ưu cho vi sinh vật phát triển. Thông thường, pH tối ưu cho các vi khuẩn hiếu khí là 6-7, tuy nhiên, giá trị pH thường giảm trong quá trình vi sinh vật phát triển. Khi đó, dung dịch NaOH được sử dụng để cân bằng lại pH được thiết lập ban đầu [7]. Ở thí nghiệm 2, sinh khối cao nhất thu nhận được ở pH 7 là 8,43 và 8,47x109 tế bào/ml ở mức thể tích tương ứng 3 lít và 8 lít. pH 5 có lượng sinh khối thấp nhất, dưới 1x109 tế bào/ml. Ở cả hai thí nghiệm, các kết quả thu được khơng có sự khác biệt đáng kể ở hai mức thể tích 3 lít và 8 lít.
46 Bảng 4.2 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định pH
Mật độ tế bào (*108 tb/ml) 3 lít 8 lít Mật độ tế bào (*108 tb/ml) 3 lít 8 lít pH 5 L1 0,69 0,51 pH 7 L1 8,44 8,52 L2 0,53 0,59 L2 8,51 8,51 L3 0,58 0,56 L3 8,35 8,39 TB 0,60 0,55 TB 8,43 8,47 pH 6 L1 3,89 3,88 pH 8 L1 6,03 6,33 L2 3,71 3,94 L2 6,01 6,49 L3 3,73 3,78 L3 5,93 6,35 TB 3,78 3,87 TB 5,99 6,39
Hình 4.9 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định pH
Các mẫu dịch sau nuối cấy ở nhiệt 50OC và pH 5, khi quan sát dưới kính hiển vi quang học có sự xuất hiện của tế bào mang bào tử Bacillus. Nhiều nghiên cứu về sinh trưởng phát triển của Bacillus đều cho thấy trong điều kiện nuôi cấy lỏng, vi khuẩn Bacillus tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 37OC, pH 7, tốc độ phân chia tối đa của Bacillus sau 40-50 phút. Ở nhiệt độ cao, giá trị pH bất lợi, hoặc điều kiện dinh dưỡng thấp, Bacillus có khả năng tạo bào tử nên vẫn tồn tại trong dịch ni cấy nhưng khơng có sự gia tăng sinh khối [1,4,15].
* Khả năng ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ
Ở thí nghiệm 3, kết quả ở hình 4.9 cho thấy ở cả hai mức thể tích 3 lít và 8 lít, đồ thị biểu diễn hàm lượng sinh khối Bacillus thu được đều đi theo thứ tự các giai đoạn của nuôi cấy theo mẻ. Với mật độ giống ban đầu là 1,05x108 tế bào/ml, sau 24 giờ, mật độ tế bào đạt 3,59
47 đến 4,04x108 tế bào/ml, sau đó giảm dần qua 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Có thể xác định ở thời điểm 24h các tế bào đang trong giai đoạn logarit có tốc độ phân chia nhanh nhất.
Bảng 4.3 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ Mật độ tế bào Mật độ tế bào (*109 tb/ml) 3 lít 8 lít Mật độ tế bào (*109 tb/ml) 3 lít 8 lít 6 giờ L1 1,23 1,48 30 giờ L1 6,03 6,33 L2 1,01 1,94 L2 6,01 6,49 L3 0,95 1,18 L3 5,93 6,35 TB 1,06 1,53 TB 5,99 6,39 12 giờ L1 2,44 2,52 36 giờ L1 5,03 6,02 L2 2,11 3,05 L2 5,98 6,55 L3 2,35 2,39 L3 6,22 6,89 TB 2,30 2,65 TB 5,74 6,49 18 giờ L1 2,89 2,33 42 giờ L1 6,03 6,26 L2 3,52 3,57 L2 5,81 6,01 L3 3,55 3,85 L3 5,12 5,82 TB 3,32 3,25 TB 5,65 6,03 24 giờ L1 4,22 5,12 48 giờ L1 4,33 5,86 L2 4,01 5,67 L2 5,24 5,12 L3 3,92 4,95 L3 4,72 5,77 TB 4,05 5,25 TB 4,76 5,58
48 Trong thời gian 96 giờ được cài đặt ở nhiệt độ 30OC, pH 7, bộ gia nhiệt hoạt động khá ổn định, biên độ dao động trong khoảng 1OC. Riêng giá trị pH có nhiều biến động, thời điểm