Với thể tích nhỏ nên hệ thống khơng sử dụng cánh khuấy mà tận dụng q trình sục khí để tạo dòng pha trộn dung dịch với tế bào ni cấy. Ống sục khí được đặt dưới đáy ngăn 2 có van điều chỉnh tốc độ sục khí. Ngồi ra, cịn có van nạp để bổ sung nguyên liệu, dung dịch dinh dưỡng từ phía hơng và van xả để lấy bớt sản phẩm sau ni cấy được đặt phía dưới ngăn 2. Cả hai van này thông trực tiếp vào dung dịch nuôi cấy bên trong ngăn 2, phục vụ cho q trình ni cấy theo mẻ mà khơng cần mở nắp ngăn.
Về nguyên vật liệu lựa chọn, có hai loại trong thiết kế bioreactor là thủy tinh và inox. Bioractor bằng thủy tinh trong suốt có ưu điểm đẹp, chịu nhiệt tốt, có thể quan sát được dung dịch bên trong, dễ vệ sinh. Tuy nhiên giá thành cao, dễ vỡ trong quá trình vận chuyển và khó gia cơng các van, ống dẫn. Nếu sử dụng thì các ống dẫn, đầu dị sẽ được thiết kế trên nắp bằng inox. Bioractor bằng inox hay còn gọi là thép khơng gỉ có ưu điểm giá thành thấp, độ bền cao, có thể thiết kế bất kỳ van ống dẫn nào dọc theo thành hệ thống. Mặc khác, vẫn có khả năng chịu nhiệt tốt và dễ dàng trong quá trình vận chuyển, sử dụng (hình 4.3).
Inox 304 hay cịn gọi là thép khơng gỉ có thành phần chủ yếu là Crom (Cr), Niken (Ni), có độ cứng, độ bền cao, bề mặt sáng bóng, khơng gỉ sét. Đặc biệt, Inox 304 có khả năng chống ăn mịn và chiu nhiệt tốt, đảm bảo an tồn vệ sinh thực phẩm nên được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Inox 316 ngồi Crom (Cr), Niken (Ni) cịn có thêm Molybdenum có khả năng chống ăn mòn cao hơn inox 304, chịu nhiệt lên đến 500 độ C nên sử dụng trong những điều kiện môi trường khắc nghiệt hơn như những vùng ven biển, muối làm tan băng, những giải pháp ngâm nước muối, hoá chất. Tuy nhiên, giá thành của inox 316 lại cao hơn, độ chịu lực thấp hơn, nhiệt độ nóng chảy cao hơn nên chi phí tạo hình sản phẩm lớn.
41 Hình 4.3 Bioreactor bằng thủy tinh và inox
42 Sau khi so sánh giữa 3 loại vật liệu, nghiên cứu lựa chọn inox 304 cho thiết kế. Quá trình được thực hiện tại Trung tâm đào tạo cơng nghệ cao Thành phố Hồ Chí Minh. Sau đó, hệ thống bioreactor được vận chuyển về phịng thí nghiệm sinh học mơi trường, Viện KHCN&QL Môi trường cho các thử nghiệm đánh giá tiếp theo (Hình 4.4).
Hình 4.5 Màn hình ứng dụng Bioreactor HC-06 Các bước vận hành như sau: Các bước vận hành như sau:
Bước 1: Bật đèn UV trong 30 phút để khử trùng hệ thống
Bước 2: Cho môi trường dinh dưỡng và giống vi sinh vật
Bước 3: Bật Bluetooth trên điện thoại Chọn thiết bị kết nối “choose a devide” chọn CONNECT (HC- 06)
Bước 4: Chọn chế độ AUTO hoặc MANUAL
Bước 5: Cài nhiệt độ muốn nuôi cấy – set temperature Bước 6: Cài thời gian nuôi cấy – Alam Time (phút) Bước 7: Chạy mơ hình – RUN
43 Ngồi ra, để tăng thêm hiệu quả và thuận tiện trong quá trình sử dụng, phần mềm Bioreactor HC-06 dùng điều khiển hệ thống thông qua kết nối bluetooth với điện thoại thơng minh. Phần mềm do nhóm thiết kế thuộc Trung tâm nghiên cứu công nghệ caoTpHCM thiết kế và bàn giao cho nhóm nghiên cứu. Phần mềm có thể cài đặt trên điện thoại có hệ điều hành Adroid. Phần mềm có cài đặt chế độ tự động (AUTO) cho hệ thống hoặc chế độ điều khiển bằng tay (MANUAL). Chế độ tự động cho phép cài đặt nhiệt độ và thời gian. Chế độ điều khiển bằng tay cho phép cài đặt và điều chỉnh thêm chức năng sục khí, quạt và đèn UV (Hình 4.5).
Ưu điểm của phần mềm Bioreactor HC-06 là dễ dàng cài đặt trên tất cả điện thoại thông minh android, thao tác dễ sử dụng. Tuy nhiên nhược điểm là chỉ có thể kết nối với hệ thống bioreactor thơng qua Bluetooth. Điều này làm giới hạn về khoảng cách kiểm soát cho người dùng.
4.2 Kết quả đánh giá vận hành hệ thống
4.2.1 Kết quả chuẩn bị giống
Theo quy trình ni cấy vi sinh vật trong các thiết bị bioreactor, chủng vi sinh vật sử dụng phải dưới dạng thuần và phải được nhân sinh khối với hàm lượng đủ lớn (trên 106 tế bào/ml) trước khi bổ sung vào hệ thống. Giống Bacillus nhận được từ Viện Sinh học thực phẩm, ĐH Công nghiệp TpHCM sau khi được kiểm tra độ thuần dưới kiến hiển vi, cấy truyền trên môi trường cao thịt peptone rắn đều cho kết quả tốt (Hình 4.7). Tế bào vi khuẩn hình que, khuẩn lạc trên mơi trường rắn màu trắng đục, lồi, mép nhăn.
(a) Khuẩn lạc trên môi trường thạch (b) Vi khuẩn Bacillus dưới kính hiển vi (c) Giống F2 trong môi trường lỏng
44
4.2.2 Kết quả thí nghiệm vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy theo mẻ
* Khả năng ổn định nhiệt độ
Mỗi tế bào vi sinh vật có một khoảng nhiệt độ và pH tối thích cho sự phát triển, vì vậy, đây là hai thơng số cần ổn định chính xác trong suốt thời gian ni cấy [7] Đối với nuôi cấy vi khuẩn, thông thường nhiệt độ tối ưu từ 25 – 35OC. Một số nhóm ưa nhiệt có thể cần ở nhiệt độ cao hơn từ 50 – 80OC [5]. Hệ thống được thiết kế theo phương pháp gia nhiệt qua thành nên thời gian để nhiệt độ phân tán đều cho toàn bộ dung dịch trong môi trường tương đối chậm. Tuy nhiên, điều này làm giảm sự tác động đột ngột của nhiệt độ đến tế bào và giúp cho sự phân tác nhiệt trong dung dịch đều đặn ổn định hơn [6].
Kết quả theo dõi nuôi cấy chủng vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy sinh khối thu nhận được ở nhiệt độ 40OC là cao nhất, trung bình là 3,11x108 tế bào/ml ở thể tích ni cấy 3 lít và 3,45x108 tế bào/ml ở thể tích ni cấy 8 lít. Ở nhiệt độ 30OC và 50OC, sinh khối giảm đáng kể, còn 1,19 đến 1,22x108 tế bào/ml ở cả 2 mức thể tích (Bảng 4.1 và hình 4.8). Nghiên cứu về Bacillus của các tác giả ….. đều cho thấy nhiệt độ tối ưu của chủng vi khuẩn này là 37OC.
So sánh ở 2 mức thể tích, mật độ tế bào thu nhận được ở các khoảng nhiệt độ khơng có sự chênh lệch đáng kể. Điều này cho thấy sự sinh trưởng phát triển theo nhiệt độ của chủng vi khuẩn diễn ra đều khắp các vị trí trong dung dịch. Tuy nhiên, trong q trình vận hành, nhận thấy khi thể tích từ 3 lít tăng lên 8 lít (gấp 2,35 lần) thì thời gian trung bình hệ thống gia nhiệt đến nhiệt độ cài đặt từ 15,1 phút tăng lên 36,1 phút (dài hơn gấp 2,39 lần). Việc gia nhiệt qua thành ở thể tích nhỏ 3 lít và thể tích lớn 8 lít chỉ có sự khác biệt về mặt thời gian, không làm ảnh hưởng đến việc phân bố nhiệt độ đều khắp toàn bộ dung dịch.
45 Bảng 4.1 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ
Nhiệt độ
3 lít 8 lít
Mật độ tế bào (*108 tb/ml)
Thời gian gia nhiệt (phút)
Mật độ tế bào (*108 tb/ml)
Thời gian gia nhiệt (phút) 30OC Lần 1 2,03 13 1,87 32 Lần 2 2,05 15 1,99 33 Lần 3 1,79 15 2,38 32 TB 1,96 14,3 2,08 32,3 40OC Lần 1 2,93 15 3,37 36 Lần 2 3,29 14 2,99 36 Lần 3 3,11 14 3,39 37 TB 3,11 14,3 3,25 36,3 50OC Lần 1 1,08 16 1,21 39 Lần 2 1,21 17 1,48 40 Lần 3 1,29 17 0,98 40 TB 1,19 16,7 1,22 39,7
Hình 4.8 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định nhiệt độ * Khả năng ổn định pH * Khả năng ổn định pH
Trong q trình ni cấy, giá trị pH được theo dõi liên tục để giữ môi trường trong phạm vi tối ưu cho vi sinh vật phát triển. Thông thường, pH tối ưu cho các vi khuẩn hiếu khí là 6-7, tuy nhiên, giá trị pH thường giảm trong quá trình vi sinh vật phát triển. Khi đó, dung dịch NaOH được sử dụng để cân bằng lại pH được thiết lập ban đầu [7]. Ở thí nghiệm 2, sinh khối cao nhất thu nhận được ở pH 7 là 8,43 và 8,47x109 tế bào/ml ở mức thể tích tương ứng 3 lít và 8 lít. pH 5 có lượng sinh khối thấp nhất, dưới 1x109 tế bào/ml. Ở cả hai thí nghiệm, các kết quả thu được khơng có sự khác biệt đáng kể ở hai mức thể tích 3 lít và 8 lít.
46 Bảng 4.2 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định pH
Mật độ tế bào (*108 tb/ml) 3 lít 8 lít Mật độ tế bào (*108 tb/ml) 3 lít 8 lít pH 5 L1 0,69 0,51 pH 7 L1 8,44 8,52 L2 0,53 0,59 L2 8,51 8,51 L3 0,58 0,56 L3 8,35 8,39 TB 0,60 0,55 TB 8,43 8,47 pH 6 L1 3,89 3,88 pH 8 L1 6,03 6,33 L2 3,71 3,94 L2 6,01 6,49 L3 3,73 3,78 L3 5,93 6,35 TB 3,78 3,87 TB 5,99 6,39
Hình 4.9 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định pH
Các mẫu dịch sau nuối cấy ở nhiệt 50OC và pH 5, khi quan sát dưới kính hiển vi quang học có sự xuất hiện của tế bào mang bào tử Bacillus. Nhiều nghiên cứu về sinh trưởng phát triển của Bacillus đều cho thấy trong điều kiện nuôi cấy lỏng, vi khuẩn Bacillus tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 37OC, pH 7, tốc độ phân chia tối đa của Bacillus sau 40-50 phút. Ở nhiệt độ cao, giá trị pH bất lợi, hoặc điều kiện dinh dưỡng thấp, Bacillus có khả năng tạo bào tử nên vẫn tồn tại trong dịch ni cấy nhưng khơng có sự gia tăng sinh khối [1,4,15].
* Khả năng ổn định thời gian ni cấy theo mẻ
Ở thí nghiệm 3, kết quả ở hình 4.9 cho thấy ở cả hai mức thể tích 3 lít và 8 lít, đồ thị biểu diễn hàm lượng sinh khối Bacillus thu được đều đi theo thứ tự các giai đoạn của nuôi cấy theo mẻ. Với mật độ giống ban đầu là 1,05x108 tế bào/ml, sau 24 giờ, mật độ tế bào đạt 3,59
47 đến 4,04x108 tế bào/ml, sau đó giảm dần qua 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ. Có thể xác định ở thời điểm 24h các tế bào đang trong giai đoạn logarit có tốc độ phân chia nhanh nhất.
Bảng 4.3 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định thời gian nuôi cấy theo mẻ Mật độ tế bào Mật độ tế bào (*109 tb/ml) 3 lít 8 lít Mật độ tế bào (*109 tb/ml) 3 lít 8 lít 6 giờ L1 1,23 1,48 30 giờ L1 6,03 6,33 L2 1,01 1,94 L2 6,01 6,49 L3 0,95 1,18 L3 5,93 6,35 TB 1,06 1,53 TB 5,99 6,39 12 giờ L1 2,44 2,52 36 giờ L1 5,03 6,02 L2 2,11 3,05 L2 5,98 6,55 L3 2,35 2,39 L3 6,22 6,89 TB 2,30 2,65 TB 5,74 6,49 18 giờ L1 2,89 2,33 42 giờ L1 6,03 6,26 L2 3,52 3,57 L2 5,81 6,01 L3 3,55 3,85 L3 5,12 5,82 TB 3,32 3,25 TB 5,65 6,03 24 giờ L1 4,22 5,12 48 giờ L1 4,33 5,86 L2 4,01 5,67 L2 5,24 5,12 L3 3,92 4,95 L3 4,72 5,77 TB 4,05 5,25 TB 4,76 5,58
48 Trong thời gian 96 giờ được cài đặt ở nhiệt độ 30OC, pH 7, bộ gia nhiệt hoạt động khá ổn định, biên độ dao động trong khoảng 1OC. Riêng giá trị pH có nhiều biến động, thời điểm 24 giờ, pH tăng đến 7,4, sau thời điểm 48 giờ, pH giảm cịn 6,5. Điều này có thể do sự thay đổi về các sản phẩm chuyển hóa mà tế bào trao đổi với mơi trường ni cấy.
4.2.3 Kết quả vận hành đánh giá khả năng ổn định của hệ thống khi nuôi cấy liên tục
Đối với tất cả các quá trình lên men, yêu cầu quan trọng nhất là phải đảm bảo sao cho mỗi tế bào tham gia đều được đặt trong điều kiện lý hóa giống nhau. Các thông số nhiệt độ, pH, hàm lượng O2, CO2 hòa tan…. thường được kiểm soát một cách trực tiếp thông qua các sensor đặt trong nồi lên men. Các thông số về hàm lượng enzyme, sinh khối, protein …. được kiểm soát giám tiếp bằng cách lấy mẫu và đem phân tích [8,9,13].
Hình 4.11 Sinh khối thu được sau 4 lần bổ sung môi trường dinh dưỡng
Trong q trình ni cấy liên tục, tế bào khơng có pha suy vong mà được duy trì ở pha cân bằng. Để quá trình thu nhận sản phầm sinh khối không làm thay đổi đột ngột trạng thái của tế bào cần đảm bảo quá trình nạp mơi trường dinh dưỡng mới vào và q trình rút dịch sản phẩm ra phải tương đương nhau về thể tích [11,14]. Trong thiết kế của hệ thống bioreactor, van nạp đặt ở bên hơng, phía trên cịn van xả đặt ở bên dưới của ngăn 2. Quá trình bổ sung được tiến hành ngay sau quá trình rút chiết. Trong q trình thực hiện, nhận thấy có sự dao động về nhiệt độ và pH khi bổ sung môi trường dinh dưỡng mới. Nhiệt độ giảm 2-5OCvà pH tăng 0,3-0,5. Bảng điều khiển hiển thị giá trị có sự thay đổi và phần mềm bioreactor_HC06
49 trên điện thoại cũng báo rung. Hệ thống mất khoảng 3-5 phút cho việc điều chỉnh nhiệt độ và pH quay lại giá trị cài đặt ban đầu. Kết quả mật độ sinh khối ở lần bồ sung dinh dưỡng thứ 3 vào thời điểm 10 giờ là cao nhất (3,21x108 tế bào/ml), thấp nhất là vào thời điểm 0 giờ (2,11x108 tế bào/ml). Quan sát dưới kính hiển vi, các sản phẩm thu nhận được sau các thời điểm đều khơng có sự xuất hiện bào tử vi khuẩn Bacillus. Điều này chứng tỏ các tế bào đang ở giai đoạn tốt nhất cho quá trình trao đổi chất [2,15].
Như vậy, bước đầu vận hành trong điều kiện nuôi cấy theo mẻ và nuôi cấy liên tục trong hệ thống đều thu nhận được sinh khối vi sinh vật ở trạng thái tốt nhất. Chu trình sinh trưởng của vi sinh vật tương ứng với điều kiện tối ưu của giống ban đầu cung cấp. Điều này cho thấy sự phát triển của vi sinh vật trong hệ thống nuôi cấy là ổn định.
Hệ thống cho thấy sự hoạt động ổn định ở mức thể tích thấp là 3 lít và 8 lít. Đây là mức thể tích phù hợp cho q trình nghiên cứu của sinh viên, giảng viên tại viện KHCN&QL Môi trường. Ở mức thể tích này, nguyên vật liệu đầu vào ít, q trình kiểm sốt cũng dễ dàng hơn từ đó giúp giảm chi phí nghiên cứu cho sinh viên và giảng viên. Mơ hình hoạt động ổ định cũng hỗ trợ cho giảng viên trong các bài giảng thực hành vi sinh môi trường, vi sinh vật học. Quá trình vận hành hệ thống sẽ giúp sinh viên có những nhìn nhận bước đầu khi vận hành cho một hệ thống quy mô công nghiệp sau này.
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận
- Đề tài đã thiết kế được mơ hình ni cấy vi sinh vật có kiểm sốt về nhiệt độ và pH dung tích 10L bằng vật liệu inox 304.
- Đề tài đã thiết kế phần mềm Bioreactor HC06 có thể cài đặt trên điện thoại adroid, kết nối qua Bluetooth đến hệ thống nuôi cấy.
- Hệ thống nuôi cấy vi sinh vật hoạt động ổn định trong giới hạn nhiệt độ từ 30-50OC, giới hạn pH từ 5 đến 8, khoảng thời gian 0-96 giờ nuôi cấy liên tục. Mật độ tế bào thu nhận được đạt 108 tế bào/ml.
- Hệ thống đảm bảo được giới hạn sinh trưởng ổn định của chủng vi khuẩn Bacillus thử nghiệm sau 5 lần bổ sung dinh dưỡng.
50 5.2 Kiến nghị
- Thử nghiệm nuôi cấy một số chủng vi khuẩn hoặc nấm men khác với khoảng nhiệt độ, pH và thời gian thay đổi khác nhau.
- Cải tiến quá trình điều chỉnh và bổ sung pH khi nuôi cấy trong thời gian liên tục trên 48 giờ.
- Cải tiến bổ sung đầu dị xác định thơng số các khí hịa tan hoặc kiểm sốt lưu lượng khí nạp vào một cách chính xác hơn, giúp cho quá trình ni cấy đạt hiệu suất cao hơn nữa.