Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phƣơng pháp định danh mẫu cây Thổ nhân sâm
Định danh mẫu cây Thổ nhân sâm dựa vào phƣơng pháp hình thái so sánh và phƣơng pháp phân loại học phân tử.
Phƣơng pháp hình thái so sánh: Tại mỗi địa phƣơng, thu 5 cây Thổ nhân sâm non và thu hạt của 5 cây Thổ nhân sâm khác đem trồng tại vƣờn Thực nghiệm khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. Đặc điểm hình thái của cây Thổ nhân sâm đƣợc quan sát trực tiếp và mô tả đặc điểm rễ, thân lá, hoa, quả, hạt. Nhận diện mẫu cây Thổ nhân sâm theo mơ tả của Phạm Hồng Hộ (1999) [1], Đỗ Tất Lợi (2004) [3] và tra cứu trên http://www.tropicos.org/Name/26200178 tại Bộ môn Thực vật học, khoa Sinh học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên.
Phƣơng pháp phân loại học phân tử dựa vào một số mã vạch DNA nhƣ vùng
ITS, đoạn gen matK, rpoC1, rpoB. Lá non của tất cả các cây Thổ nhân sâm trong
vƣờn Thực nghiệm đƣợc sử dụng cho tách chiết DNA bằng phƣơng pháp CTAB theo Shanghai-Maroof và cs (1984) [101]. DNA tổng số đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8 %.
Trình tự nucleotide của các cặp mồi matK-F/matK-R, ITS-F/ITS-R, rpoC1- F/rpoC1-R, rpoB-F/rpoB-R sử dụng trong PCR đƣợc tổng hợp theo Kress và cs
(2005) [53] đƣợc thể hiện ở bảng 2.1.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đối với hai cặp mồi rpoC1-F/rpoC1-R, rpoB- F/rpoB-R là 94oC trong 1 phút, lặp lại 40 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 53oC trong 40 giây và tổng hợp ở 72oC trong 40 giây; sau 40 chu kỳ là bƣớc kết thúc ở 72oC trong 5 phút, lƣu giữ ở 4oC. Chu trình nhiệt của PCR đối với cặp mồi ITS-F/ITS-R là 94o
C trong 5 phút, lặp lại 40 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 94oC trong 1 phút, gắn mồi ở 58oC trong 1 phút và tổng hợp ở 72oC trong 1 phút; sau 40 chu kỳ là bƣớc kết thúc ở 72oC trong 5 phút, lƣu giữ ở
47
4oC. Chu trình nhiệt của PCR với cặp mồi matK-F/matK-R là 95o trong 2 phút, lặp lại 35 chu kỳ và ở mỗi chu kỳ, biến tính ở 95oC trong 30 giây, gắn mồi ở 52o
C trong 30 giây và tổng hợp ở 72oC trong 45 giây; sau 35 chu kỳ là bƣớc kết thúc ở 72oC trong 5 phút, lƣu giữ ở 4oC.
Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 %. Sản phẩm PCR từ gel điện di đƣợc tinh sạch bằng bộ Kit QiAquick Gel Extraction (Qiagen, Đức). Sản phẩm này đƣợc sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp bằng thiết bị tự động ABI PRISM 3500 XL (Applied Biosystems, M ) theo nguyên lí của Sanger với bộ kit BigDye terminator cycler v3.1. Trình tự nucleotide đƣợc so sánh với các trình tự đã có trên GenBank bằng phần mềm BLAST trong NCBI (http:www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Trình tự DNA sau khi đọc đƣợc hiệu chỉnh với sự trợ giúp của phần mềm Bioedit v7.0.5.2.
Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phƣơng pháp Neighbor-Joining nhờ phần mềm Mega 7 [56].