Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. FLAVONOID VÀ CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở THỰC VẬT
1.2.2. Con đƣờng tổng hợp flavonoid ở thực vật
Con đƣờng sinh tổng hợp flavonoid là một trong những lĩnh vực đƣợc nghiên cứu nhiều nhất của các hợp chất phenolic ở thực vật. Flavonoid đƣợc chia thành các phân nhóm (flavanone, flavon, flavonol, leucoanthocyanidin, anthocyanin và isoflavonoid) và tập trung chủ yếu ở hoa, quả và lá [103]. Hợp chất flavonoid đƣợc tổng hợp theo con đƣờng phenylpropanoid, đây chính là con đƣờng tổng hợp thứ cấp chủ yếu của thực vật bậc cao (Hình 1.6). Nguyên liệu đầu tiên là amino acid L- phenylalanine (L-Phe) hoặc trong vài trƣờng hợp là L-tyrosine (L-Tyr) đƣợc chuyển hóa hành 4-coumaroyl CoA (hoặc một este thiol tƣơng ứng với sự xuất hiện của 4-
29
hydroxycinnamate khác). Sau đó, những este này đƣợc sử dụng nhƣ là tiền chất để tổng hợp các hợp chất nhƣ: flavonoid, lignin, lignan, coumarin, furanocoumarin và stilbene [29 . Các giai đoạn của con đƣờng phenylpropanoid đƣợc xúc tác bởi hệ thống các enzyme chủ chốt nhƣ: phenylalanine ammonia- lyase (PAL), cinnamate 4-hydroxylase (C4H), 4-coumarate CoA ligase (4CL), chalcone synthase (CHS), chalcone isomerase (CHI), flavone synthase II ((FNS II), flavanone-3-hydroxylase (F3H), flavonol synthase (FLS), dihydroxyflavonol 4-reductase (DFR), leucoanthocyanidin oxygenase (LDOX), isoflavone synthase và isoflavone reductase (IFS), các enzyme này đƣợc mã hóa bởi hệ thống gen tƣơng ứng [7].
Phenylalanine ammonia- lyase (PAL)
PAL đã đƣợc tìm thấy trong tất cả các thực vật bậc cao, một số nấm và vi khuẩn, nhƣng khơng tìm thấy ở động vật. PAL là một enzyme quan trọng trong con đƣờng phenylpropanoid, có vai trị xúc tác cho q trình khử amin của amino acid L-Phe tạo thành trans-cinammate và ion amoni (NH3). PAL cũng có thể sử dụng các amino acid L-Tyr làm nguyên liệu ở các loài cây Một lá mầm [95 . PAL đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi vì có vai trị quan trọng trong các phản ứng stress của thực vật, bảo vệ thực vật chống lại bức xạ tia cực tím, nhiệt độ thấp, hàm lƣợng đạm, lân, sắt cao, sự tấn công của các tác nhân gây bệnh và phản ứng ethylene [72].
Cinnamate 4-hydroxylase (C4H)
C4H là một enzyme oxyreductase xúc tác tổng hợp giai đoạn hai của con đƣờng phenylpropanoid. Enzyme này xúc tác cho phản ứng kết hợp một nguyên tử oxy với một phân tử trans-cinnamate với sự tham gia của NADPH, H+ và nhóm heme đóng vai trị nhƣ một cơ chất, tạo ra một phân tử 4-hydroxycinnamate, NADP và H2O [19].
4- Coumarate CoA ligase (4CL)
4CL xúc tác phản ứng chuyển đổi 4-coumarate (hoặc p-coumaric acid) để tạo thành 4-coumaroyl-CoA với sự tham gia của ATP. Costa và cs (2005) sử dụng phƣơng pháp xét nghiệm enzyme ở cây A. thaliana đã xác định enzyme này có thể xúc tác cho q trình chuyển hóa các dẫn xuất của acid cinnamic (acid caffeic, acid ferulic, acid 5-hydroxyferulic và acid sinapic) thành các hợp chất phenylpropanoid
30
nhƣ flavonoid, coumarin và lignin [20 . 4CL đóng vai trị là enzyme chìa khóa trong việc liên kết nhánh trung tâm của quá trình sinh tổng hợp phenylpropanoid với các nhánh riêng tổng hợp các phenolic cụ thể [128].
Chalcone synthase (CHS)
CHS là enzyme xúc tác bƣớc khởi đầu trong quá trình sinh tổng hợp các flavonoid cụ thể. Dƣới tác dụng của chalcone synthase, naringenin chalcone mạch hở đƣợc tạo thành thông qua phản ứng ngƣng tụ giữa một phân tử 4-coumaroyl- CoA và 3 phân tử malonyl-CoA [97]. Có rất nhiều nghiên cứu cho thấy CHS bị ức chế bởi các sản phẩm trung gian của con đƣờng tổng hợp flavonoid nhƣ naringenin, naringenin chalcone và este CoA. Ví dụ, các CHS của mùi tây bị ức chế 50 % bởi 100 μM naringenin và 10 μM este CoA; các flavonoid nhƣ luteolin và apigenin là chất ức chế CHS của lúa mạch đen trong ống nghiệm, trong khi ở cà rốt chỉ có naringenin và chalcone narigenin có thể ức chế CHS ở nồng độ 100 μM. Ở thực vật, CHS có thể ln có mặt trong tế bào nhƣng chỉ có hoạt tính trong điều kiện nhất định ví dụ nhƣ khi gặp các stress, nhƣ các vi sinh vật gây bệnh, các bộ phận của cây bị thƣơng, đặc biệt là tia cực tím dẫn đến tăng sản xuất chất flavonoid [88].
Chalcone isomerase (CHI)
CHI hoặc chalcone-flavanone isomerase là enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid bằng việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở đƣợc đóng vịng để hình thành các naringenin. Sau đó, hợp chất này sẽ đƣợc chuyển hóa thành nhiều loại flavonoid chính nhƣ: flavanone, flavonol và anthocyanin [29 , [45] (Hình 1.6).
Flavone synthase (FNS)
Flavone synthase xúc tác biến đổi một flavanone, 2-oxoglutarate và O2 để tạo thành sản phẩm một flavone, succinate, CO2 và H2O. Flavone đƣợc tổng hợp trực tiếp tại một điểm của nhánh tổng hợp anthocyanidin từ flavanone. Ở thực vật bậc cao phát triển hai hệ thống enzyme hồn tồn độc lập có thể trực tiếp tạo ra flavone từ flavanone đó là FNS I và II. Cả hai enzyme không bao giờ biểu hiện cùng nhau trong một cơ thể. FNS I có ở các cây trong họ Hoa tán. FNS II có ở hầu hết các lồi
31
thực vật. Cả hai FNS I và II có vai trị xúc tác quan trọng tại một chi nhánh của con đƣờng tổng hợp các flavonoid khác nhau, chẳng hạn nhƣ flavone, isoflavone, flavonol, flavanol và anthocyanin [73].
Hình 1.6. Con đƣờng phenylpropanoid (phản ứng xúc tác bởi CHI màu xanh)
(Nguồn: Oliver và cs (2005) [87])
Flavanone-3-hydroxylase (F3H)
F3H là một enzyme quan trọng giữ vị trí đầu tiên của nhánh tổng hợp flavonol bằng cách chuyển đổi flavanone (2S)-naringenin thành (2R, 3R)-dihydrokaempferol và (2S)-eriodictyol thành (2R, 3R)-dihydroquercetin [7].
Flavonol synthase (FLS)
FLS thuộc họ enzyme 2-oxoglutaratedependent dioxygenase và là một trong những enzyme chính của quá trình sinh tổng hợp flavonol, xúc tác biến đổi (2R,
32
3R)-dihydroflavonol (tức là dihydrokaempferol) để tạo ra flavonol tƣơng ứng (kaempferol) [76].
Dihydroxyflavonol 4-reductase (DFR)
DFR là một enzyme quan trọng của quá trình sinh tổng hợp flavonoid. DFR sử dụng NADPH để biến đổi dihydroflavonol tạo thành leucoanthocyanidin, đó là tiền chất chung cho sự hình thành anthocyanin và proanthocyanidin [89], [35].
Leucoanthocyanidin oxygenase (LDOX)
LDOX có vai trị xúc tác chuyển đổi leucoanthocyanidin không màu để tạo anthocyanidin có màu. Đó là một bƣớc quan trọng trong sự hình thành các chất chuyển hóa có màu trong sinh tổng hợp anthocyanin [22].
Isoflavone synthase (IFS)
IFS đóng một vai trị quan trọng trong sinh tổng hợp isoflavone. IFS là một enzyme xúc tác đặc biệt vì xúc tác cho hai phản ứng của cùng một cơ chất, đó là phản ứng thủy phân và phản ứng dịch chuyển aryl nội phân tử. Trong con đƣờng chuyển hóa phenylpropanoid, flavanone đƣợc chuyển đổi thành 2- hydroxylisoflavavone, sau đó tạo thành isoflavone qua 3 bƣớc. Đầu tiên, một gốc tại C3 đƣợc tạo ra và sau đó sắp xếp lại dịch chuyển nhóm aryl nội phân tử từ C2 đến C3 và để lại một nhóm hydroxyl vẫn gắn liền với C2. Cuối cùng, enzyme isoflavavone dehydratase chuyển đổi 2-hydroxyisoflavanone thành isoflavone [87].
Có nhiều bằng chứng thực nghiệm ủng hộ giả thuyết này, thay vì isoflavone thì sản phẩm cuối cùng của enzyme IFS là 2-hydroxyisoflavanone. Thử nghiệm cho liquiritigenin và naringenin ủ với IFS có chứa microsomes, sản phẩm thu đƣợc là 2- hydroxyisoflavanone. Vì lý do này, “2-hydroxyisoflavanone synthase” là tên chính xác hơn cho enzyme “isoflavone synthase”. Tuy nhiên, ở thực vật không thuộc họ đậu, khi chỉ có gen IFS thì chỉ tích lũy isoflavone mặc dù theo cơ chế phản ứng là
tích lũy 2-hydroxyisoflavanone. Điều này đƣợc lý giải do 2-hydroxyisoflavanone tự động chuyển đổi nhanh tạo ra isoflavone hoặc do có enzyme “flavonoid dehydratase” làm mất nƣớc hoặc cũng không thể loại trừ khả năng IFS hỗ trợ việc chuyển đổi này với một tốc độ chậm hơn so với phản ứng dịch chuyển aryl. IFS
33
đƣợc chia làm 2 loại là IFS1 (có thể chuyển đổi liquiritigenin thành daidzein) và IFS2 (chuyển đổi cả naringenin thành genistein và liquiritigenin thành daidzein cùng một lúc) [87].
Nhƣ vậy, có thể nói flavonoid là một trong những nhóm hợp chất phong phú và đa dạng nhất trong tự nhiên, có vai trị rất quan trọng đối với thực vật và con ngƣời. Đặc biệt đối với con ngƣời, flavonoid có tác dụng chống oxy hóa, ung thƣ, viêm nhiễm, bảo vệ gan… Flavonoid đƣợc tổng hợp qua con đƣờng phenylpropanoid, chuyển hóa phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA và sau đó 4- coumaroyl-CoA sẽ đi vào quá trình tổng hợp flavonoid. Quá trình tổng hợp flavonoid cần rất nhiều các enzyme tham gia, trong đó chalcone isomerase (CHI) là một enzyme quan trọng xúc tác cho q trình đóng vịng phân tử naringenin chalcone mạch hở thành (2S)-naringenin, một hợp chất thiết yếu trong quá trình sinh tổng hợp genistine, anthocyanin và các flavonoid khác. Nghiên cứu làm rõ vai trị, cấu trúc hóa học cũng nhƣ con đƣờng tổng hợp flavonoid ở thực vật nói chung và cây Thổ nhân sâm nói riêng, trong đó làm sáng tỏ vai trị của enzyme chìa khóa CHI có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện hàm lƣợng flavonoid ở cây Thổ nhân sâm bằng công nghệ gen.