Chƣơng II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa và định danh các chủng LAB được
đƣợc tuyển chọn
2.2.5.1. Xác định đặc điểm sinh hóa bằng Kit API 50 CHL
Các chủng LAB tuyển chọn được tiến hành định xác định đặc điểm sinh hóa sử dụng kit API50 CHL (Biomerieux) dùng cho vi khuẩn lactic.
2.2.5.2. Định tên bằng phương pháp so sánh trình tự 16S DNA
Trình tự gen 16S rRNA của các chủng LAB được khuếch đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R có trình tự như trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S
rRNA.
Tên đoạn mồi Trình tự mồi
27F 5’-TAACACATGCAAGTCGAACG-3’
1429R 5’-GGTGTGACGGGCGGTGTGTA-3’
Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên
gel agarose 1,0%. Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được
so sánh với thang DNA chuẩn 1kb (Thermo scientific, Mỹ). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit PureLinkTM – DNA Purifcation (Invitrogen, Mỹ) và giải trình
tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM®3100-Avant Genetic Analyzer
(Applied Biosystems, Foster City, CA, Mỹ) tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trình tự gen 16S rRNA được so sánh với các trình tự tương ứng trên GenBank (NCBI) nhờ công cụ BLAST. Cây phát sinh chủng loại được thiết lập bằng phần mềm MEGA7, sử dụng phương pháp
Neighbor-joining. Phân tích giá trị Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với 1000 mẫu thử [Kumar S, 2016].
28
2.2.6. Nghiên cứu ứng dụng các chủng đƣợc tuyển chọn trong lên men sản xuất nƣớc mắm
2.2.6.1. Chuẩn bị giống
Hai chủng được lựa chọn là CH2-4 và CH6-2 được nuôi cấy trong môi trường FB25, pH 7,0 ở 30°C trong 7-10 ngày theo điều kiện yếm khí để đạt mật độ tế bào xấp xỉ 105-106 CFU/ml. Dịch lên men này được dùng làm giống khởi động cho quá trình lên men nước mắm được thử nghiệm.
2.2.6.2. Lên men nước mắm
Một kg cá cơm được rã đơng trong bình thủy tinh, ủ trong bể ổn nhiệt 65°C cho
đến khi nhiệt độ của mẫu đạt 65°C. Thêm 0,25% Alcalase 2.4L và ủ trong 2 giờ. Sau đó, các mẫu được làm nguội đến 50°C và thêm 0,5% Flavouzyme 500L, ủ
ở 50°C trong 4 giờ (Yongsawatdigul et al., 2007) [41]. Các mẫu được giữ ở nhiệt
độ phòng cho đến khi đạt được nhiệt độ 35°C, sau đó thêm 25% (w/w) NaCl và 10%
(v/w) giống khởi động. Mẫu đối chứng được thêm 10% FB25 mà khơng có LAB. Quá trình lên men nước mắm được thực hiện ở nhiệt độ 35oC trong 6 tháng. Sự thay đổi vi sinh vật, độ đạm, hàm lượng axit amin được theo dõi ở thời điểm 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 và 180 ngày lên men. Các hợp chất dễ bay hơi của mẫu được phân tích ở thời điểm 30, 120 và 180 ngày. Các tính chất hóa lý khác như hàm lượng muối, màu sắc, nitơ amoni và hàm lượng nitơ tổng, được xác định ở 180 ngày lên men [37].
Sau các thời quãng thời gian lên men (0, 15 , 30, 60, 90, 120, 150 và 180 ngày), tiên hành lấy mẫu (10g) trong điều kiện vô trùng và tiến hành xác định hàm lượng axit amin tự do được sinh ra theo phương pháp ninhydrin dùng dùng glutamic 1mg/mL như một chất chuẩn.
Tiến hành: Lấy 0,1mL dịch thủy phân cá + 1mL ninhydrin 2% + 1mL pyridine 20%. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở điều kiện 70-75 °C trong thời gian 10
29
phút, để nguội ở nhiệt độ thường, đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 570nm. Lượng axit amin được xác định theo đường chuẩn glutamic mô tả trong Phụ lục 2.
Phương trình đường chuẩn thiết lập được: Y= 19,794x + 0,2571; R2= 0,9933
Trong đó: Y là giá trị OD của mẫu
X là nồng độ axit amin (mg/ml)
2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả nghiên cứu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm excel. Phần mềm sử dụng các hàm tính tốn dựa trên những cơng thức cơ bản của thống kê trong đó có cơng thức:
Giá trị trung bình ( ):
Độ lệch chuẩn ( ):
Sai số m:
30
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu nƣớc nƣớc mắm 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu nƣớc nƣớc mắm
Vi khuẩn lactic được phân lập từ chượp nước mắm ở các tháng 2,3,4,5,6,7,8 của các mẫu nước mắm Cát Hải và Vinh trên môi trường MRS bổ sung NaCl và CaCO3 theo phương pháp mô tả ở mục 2.1. Kết quả định lượng được thể hiện trên Bảng 3.1. Số lượng vi sinh vật đếm được ở các mẫu nước mắm khác nhau thì khác nhau. Điều này chứng tỏ sự đa dạng của vi sinh vật trong vật liệu thô cũng
như trong quá trình lên men. Bổ sung CaCO3 vào mơi trường MRS giúp trung
hịa acid lactic do LAB tạo ra, giúp duy trì pH tối ưu. Hơn thế nữa ion Ca2+ được
sử dụng cho sự vận chuyển cơ chất của cầu khuẩn lactic (Teuber, 1995) [32]. Bảng 3. 1. Lượng LAB trong các mẫu nước mắm
Mẫu nƣớc
Cát Hải
Từ kết quả biểu thị trên Bảng 3.1 ta thấy LAB được tìm thấy trong tất cả các mẫu nước thu thập được, mật độ dao động từ 3,3 đến 7,6 log (cfu/ml). Ở các chượp ít ngày mật độ LAB cao và giảm dần theo thời gian lên men. Các mẫu nước mắm Cát Hải có mật độ LAB cao hơn so với mẫu nước mắm ở Cửa Hội - Vinh. Trong
31
nghiên cứu của Udomsil mật độ LAB thấp hơn dao động từ 2.11- 4.26 log (cfu/ml) tuy nhiên mật độ LAB khơng có xu hướng giảm theo thời gian như trong nghiên cứu này [36]. Điều này có thể được giải thích là do sự khác nhau của nguyên liệu
thô và phương pháp lên men giữa các nhà máy xản xuất nước mắm [22].
3.2. Đặc điểm hình thái, sinh lý các chủng phân lập đƣợc
3.2.1. Hình thái LAB
Sau quá trình phân lập, 17 chủng LAB được lựa chọn ngẫu nhiên dựa trên sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc. Các khuẩn lạc được ria thuần khiết trên mơi trường MRS có bổ sung 10 % NaCl, 0,5% CaCO3 , thử hoạt tính catalase, quan sát tế bào bằng phương pháp nhuộm gram. Bảng 3.2 và 3.3 mô tả đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của 17 chủng lựạ chọn.
Bảng 3.2. Đặc điểm khuẩn lạc
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
1 CH2-1
ngày.
32
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
2 CH2-2
3 CH2-3
4 CH2-4
Màu trắng, bóng,hơi lồi, mép mịn, đường kính 1-2mm. Thời gian mọc 4-5 ngày
Màu trắng trong hơn, bóng, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1-2mm. Thời gian mọc 3-5
ngày
Màu trắng ngà, bóng, hơi lồi, bóng, mép mịn, đường kính 1- 2mm. Thời gian mọc 4-5 ngày, mùi hôi
33
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
5 V3-1
6 V3-2
7 V3-3
Màu trắng ngà, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1-1.5mm. Thời gian mọc 3-5 ngày, mùi
hơi
Màu trắng, bóng, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1-1.5mm. Thời gian mọc 3-5 ngày, mùi
hơi
Màu trắng sữa, bóng, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1- 2.5mm. Thời gian mọc 4-5 ngày, mùi hôi
34
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
8 CH4-2
9 V5-1
10 CH6-1
Màu trắng ngà, bóng, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1-2mm. Thời gian mọc 4-5 ngày,
Màu trắng trong, bóng, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1- 1.5mm. Thời gian mọc 4-5 ngày, mùi hôi
Màu trắng đục, mùi hôi, mịn, hơi lồi, khơng bóng, mép mịn, đường kính 0.5-1mm
35
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
11 CH6-2
12 V7-2
13 CH8-1
Màu trắng sữa, mùi hơi, mịn, hơi lồi bóng, mép mịn, đường kính 1-1,5mm
Màu trắng ngà, hơi lồi, bóng, mép mịn, đường kính 1-2mm. Thời gian mọc 4-5 ngày, mùi hơi
Màu trắng trong, bóng, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1-2mm. Thời gian mọc 3-5 ngày, mùi hơi
36
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
14 CH8-2
15 CCH8-1
16 CCH8-2
Màu trắng ngà, bóng, hơi lồi, mép mịn, đường kính 1- 2.5mm. Thời gian mọc 4-5 ngày, mùi hơi.
Màu trắng sữa, mép mịn, đường kính 1-1.5mm. Thời gian mọc từ 3-5 ngày.
Màu trắng ngà, mép mịn, đường kính 1-2mm. Thời gian mọc 3-5 ngày.
37
STT Tên chủng Khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc
Màu trắng trong, hơi lồi, mép
CCH8-3 mịn, đường kính 1-2mm. Thời gian mọc 3-5
ngày. STT Chủng 1 CH2-1 bốn, cặp đôi, hoặc tạo thành đám. 2 CH2-2 bốn, cặp đôi, hoặc tạo thành đám. 38
STT Chủng 3 CH2-3 tạo thành đám. 4 CH2-4 tạo thành đám. 5 V3-1 tạo thành đám. 39
STT Chủng 6 V3-2 tạo thành đám. 7 V3-3 tạo thành đám. 8 CH4-2 tạo thành đám. 40
STT Chủng 9 V5-1 tạo thành đám. 10 CH6-1 tạo thành đám. 11 CH6-2 tạo thành đám. 41
STT Chủng 12 V7-2 tạo thành đám. 13 CH8-1 bốn, cặp đôi, hoặc tạo thành đám. 14 CH8-2 tạo thành đám. 42
STT Chủng 15 CCH8-1 tạo thành đám. 16 CCH8-2 bốn, cặp đôi, hoặc tạo thành đám. 17 CCH8-3 tạo thành đám.
Kết quả thể hiện trên Bảng 3.2 và 3.3 cho thấy 17 chủng lựa chọn đều có hình thái khuẩn lạc phù hợp với mô tả của Tetragenococcus, c
. Về hình thái tế bào chủng đều là cầu khuẩn Gram
+ -1 µm. bốn
phù hợp với mơ tả hình thái tế bào Tetragenococcus[32].
3.2.2. Khả năng sinh catalase các chủng LAB
Quá trình phân lập và tuyển chọn LAB gặp nhiều khó khăn do có những tương
đồng về đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào giữa LAB và Staphylococcus: cầu
khuẩn Gram +, bắt cặp đôi hay 4 hoặc tạo đám, sinh trưởng trong điều kiện kị khí trên
mơi trường MRS. Thử hoạt tính catalase của các chủng là thí nghiệm nhằm phân
biệt LAB với Staphylococcus. Kết quả cho thấy tất cả 17 chủng phân lập được đều thể hiện hoạt tính catalase âm tính, phù hợp với đặc điểm LAB được mô tả.
3.2.3. Khả năng chịu mặn của các chủng LAB
Tất cả các chủng LAB lựa chọn đều có đặc điểm hình thái là cẩu khuẩn, đứng thành cặp hoặc xếp thành 4. Pediococcus cũng là LAB, cầu khuẩn đứng thành cặp hoặc xếp thành 4 có thể phát triển trong khoảng nồng độ muối từ 0- 10% NaCl. Tetragenococcus mang những đặc điểm trên và phát triển được ở nồng độ muối trên 18% NaCl (Hozapfel et al, 2006) [31][13]. Để phân biệt giữa 2 nhóm, tiến hành kiểm tra sự phát triển của chủng trong môi trường MRS có bổ sung 10 và 18% NaCl theo phương pháp mô tả cở mục 2.2.3.3.
Tiến hành khảo sát khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối cao đối với các chủng. Kết quả Bảng 3.4 cho thấy cả 17 chủng đều có khả năng sinh trưởng trên môi
trường 10% và 18% NaCl làm giảm pH ban đầu chứng tỏ các chủng phân lập được đều chịu mặn và có khả năng là Tetragenococcus. Khả năng sinh trưởng của 17 chủng trên môi trường 18% NaCl thấp hơn trên môi trường 10% NaCl thể hiện ở giá trị OD thấp hơn, giá trị pH cao hơn. Nhìn chung các chủng phân lập được ở các mẫu lấy từ chượp nhiều tháng thì khả năng sinh trưởng kém hơn các chủng phân lập
ở mẫu chượp lên men những tháng đầu. Kết quả này phù hợp với kết quả định lượng LAB ở Bảng 3.1.
Các chủng CH2-4 và CH6-2 có khả năng sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nồng độ muối cao được thể hiện ở giá trị pH và OD600 có thể đặt giả thiết về tiềm năng ứng dụng làm chủng khởi động trong các nghiên cứu tiếp theo.
44
Bảng 3. 4. Khả năng sinh trưởng trong MRS 10%NaCl và MRS 18%NaCl STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Chƣợp tháng 0 2 3 4 5 6 8
3.3. Khả năng sinh enzyme của các chủng LAB phân lập đƣợc
3.3.1. Định tính khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng
Hoạt tính protease và lipase của các chủng lựa chọn được kiểm tra theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.4.1. Hoạt tính protease và lipase giúp cho vi khuẩn LAB thủy phân protein và lipid trong quá trình hình thành nước mắm. Kết quả hiển thị trên Bảng 3.5 cho thấy có 5/17 chủng khơng xuất hiện vịng thủy phân trên môi
trường bổ sung sữa gầy và 5/17 chủng không xuất hiện vịng trắng đục trên mơi trường bổ sung Tween 80 chứng tỏ hoạt tính protease và lipase rất yếu. Trong
số đó chỉ có 2 chủng V3-3 và CCH8-3 thể hiện đồng thời hoạt tính protease và lipase rất yếu, cịn lại các chủng đều có hoạt tính protease và lipase từ yếu đến
tương đối mạnh. Các chủng CH8-1 và CH6-1 lần lượt là các chủng thể hiện hoạt
tính protease và hoạt tính lipase mạnh nhất. Có 10/17 chủng thể hiện cả 2 hoạt tính, khơng cùng thể hiện mạnh nhưng có thể đặt giả thiết rằng những chủng này có khả năng thủy phân cá tốt trong quá trình lên men nước mắm.
Bảng 3. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 46
Trong đó:
- Khơng có hoạt tính +Hoạt tính yếu
++Hoạt tính trung bình +++Hoạt tính mạnh
3.3.2. Tuyển chọn chủng LAB sinh protease hoạt tính cao
3.3.2.1. Đánh giá khả năng sinh protease của LAB
Các chủng phân lập được được kiểm tra khả năng sinh trưởng trong mơi
trường có độ muối cao (FB25). Các thành phần của nước luộc cá được so sánh
gần giống với môi trường lên men nước mắm. Theo Saisithi và cộng sự, hoạt động thủy phân protein có chức năng giải phóng amino acid cho sự phát triển hương
của nước mắm [26]. Các chủng sử dụng oligopeptide trong việc hình thánh các
hợp chất bay hơi. Nồng độ oligopeptide giảm so với nồng độ oligopeptide ban đầu có trong mơi trường cho thấy năng lực của các chủng trong việc sử dụng oligopeptide tạo thành acid amin cũng như cung cấp cơ chất cho việc hình thành hợp chất có mùi thơm, chính vì thế mà có thể thấy tiềm năng sử dụng vi khuẩn lactic trong việc nâng cao chất lượng hương vị nước mắm.
Thí nghiệm được thực hiện theo mơ tả tại mục 2.2.4.3. Kết quả đươc thể hiện trong Bảng 3.6.
47
Bảng 3. 2. Khả năng sử dụng protein và sinh oligopeptide của các chủng Mẫu Cat Hai Cua Hoi 48
Sau 7 ngày nuôi cấy độ pH dịch nuôi cấy giảm nhẹ từ pH ban đầu là 6,3 xuống pH trong khoảng tử 5,89 đến 6,28. So sánh với kết quả trên Bảng 3.5 khi nuôi cấy trên FB25 độ pH giảm ít hơn nhiều so với ni cấy trên mơi trường MRS. Sự giảm pH có thể là do q trình sinh axit của LAB.
Sự giảm nồng độ protein trong dịch cá sau 7 ngày nuôi cấy so với dịch ban đầu thể hiện khả năng thủy phân protein cá của LAB. Sự giảm protein càng nhiều chứng tỏ lượng protein được sử dụng càng nhiều. Protein được sử dụng để phục vụ sinh trưởng của vi khuẩn lactic cũng như để sinh oligopeptide là tiền chất cho các chất bay hơi tạo hương cho nước mắm. Trong khi tất cả các chủng phân lập được ở nghiên cứu này đều làm tăng lượng oligopeptide, một số chủng phân lập trong nghiên cứu của Udomsil đã làm giảm oligopeptide [36]. Sự gia tăng hàm