CHƯƠNG III.
3.1.5. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phƣơng pháp PCR và enzyme cắt giới hạn
enzyme cắt giới hạn
Các thể biến nạp cho kết quả PCR khuẩn lạc dƣơng tính đƣợc tiếp tục tách chiết thu nhận plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp SDS-kiềm. Sau đó, các plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 đƣợc phân tích bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu
FGF2F/FGF2-R, cặp mồi T7promoter/T7terminator và bằng enzyme cắt hạn chế. Kết quả kiểm tra đƣợc trình bày ở hình 3.5.
Ở giếng thứ 3 (hình 3.5), xuất hiện một vạch có kích thƣớc nằm giữa hai vạch thang 250bp và 500bp, tƣơng ứng với kích thƣớc gen fgf-2 đƣợc khuếch đại bằng mồi đặc hiệu (438bp). Bên cạnh đó, sản phẩm PCR plasmid tái tổ hợp bằng cặp mồi
T7promoter/T7terminator cho một vạch có kích thƣớc nằm giữa khoảng 500-700bp tƣơng ứng với tổng kích thƣớc của gen fgf-2 (438bp) và một phần trình tự giữa hai mồi trên plasmid (giếng 5).
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 bằng phương pháp
PCR và cắt hạn chế; giếng 1, Thang DNA 1kb; giếng 2, PCR plasmid pET-His với cặp mồi FGF2-F/FGF2-R; giếng 3, PCR plasmid pET-fgf2 bằng mồi FGF2F/FGF2-R; giếng 4, PCR plasmid pET-His bằng cặp mồi MCS
T7promoter/T7terminator; giếng 5, PCR plasmid pET-fgf2 bằng cặp mồi T7promoter/T7terminator; giếng 6, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2; giếng 7,
Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 cắt bằng enzyme EcoRI; giếng 8, Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 cắt bằng hai enzyme BamHI và NdeI.
Đồng thời, plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi đƣợc cắt bằng EcoRI cho một vạch có kích thƣớc ngang với vạch thang 5000bp của thang chuẩn, chứng tỏ plasmid này đã đƣợc chèn thêm một đoạn gen. Plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 khi đƣợc cắt bằng
BamHI và NdeI cho hai vạch tƣơng ứng với kích thƣớc plasmid pET-His (4636bp) và đoạn gen fgf2 (438bp) đƣợc nối vào (giếng 8).
Các kết quả phân tích bằng phƣơng pháp PCR và enzyme cắt giới hạn cho phép kết luận chúng tôi có thể đã nối thành công gen fgf2 vào plasmid pET-His.